不同電針刺激強(qiáng)度對糖尿病胃輕癱大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)及饑餓素的影響

吳雪芬 劉麗 鄭雪娜 郭鑫 謝志強(qiáng) 謝莉娜 袁建菱 岳增輝

摘要：目的 觀察不同電針刺激強(qiáng)度對糖尿病胃輕癱（DGP）大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)和饑餓素的影響，探討不同電針刺激強(qiáng)度治療DGP的效應(yīng)差異。方法 60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和小、中、大刺激量組，每組12只。采用單次腹腔注射2%鏈脲佐菌素配合高脂高糖飲食建立DGP大鼠模型。造模成功后，分別采用電針小、中、大刺激量進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)15 d。用血糖儀和血糖試紙每周測定血糖；治療結(jié)束后以酚紅為標(biāo)記物，觀察大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率；ELISA檢測血清饑餓素含量，RT-PCR檢測下丘腦饑餓素的mRNA表達(dá)，免疫組化檢測下丘腦饑餓素的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率顯著降低，血清饑餓素含量、下丘腦饑餓素 mRNA表達(dá)顯著降低，下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)顯著升高；與模型組比較，各針刺組大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率、血清饑餓素含量、下丘腦饑餓素 mRNA表達(dá)顯著升高，下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)明顯降低，且大刺激量組優(yōu)于中、小刺激量組。結(jié)論 電針可通過上調(diào)饑餓素含量有效促進(jìn)DGP大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)，改善胃排空遲緩癥狀，且大刺激量組療效更佳。

關(guān)鍵詞：糖尿病胃輕癱；電針；刺激強(qiáng)度；饑餓素；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.009

中圖分類號：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0036-05

Effects of Different Electroacupuncture Intensity

on Gastrointestinal Motility and Ghrelin of Diabetic Gastroparesis Rats

WU Xue-fen， LIU Li， ZHENG Xue-na， GUO Xin， XIE Zhi-qiang， XIE Li-na， YUAN Jian-ling， YUE Zeng-hui

Acupuncture and Massage College， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China

Abstract： Objective To observe the effects of different electroacupuncture （EA） intensity on gastrointestinal motility and expression of Ghrelin in hypothalamus in diabetic gastroparesis （DGP） rats； To explore the effedt differences of different EA intensity. Methods Sixty rats were randomly divided into normal control group， model group， weak EA stimulation group， middle EA stimulation group， and strong EA stimulation group， with 12 rats in each group. The DGP model was established by intraperitoneal injection of 2% streptozotocin and raised by high-sugar and high-fat fodder. After modeling， each EA stimulation group was intervened by EA with different intensity， for 15 d. Blood glucose was measured weekly with blood glucose meter and blood glucose test strips. After the treatment， phenol red was taken as a marker to observe the gastric emptying rate and small intestine propulsion rate. Serum Ghrelin levels were detected by ELISA， and mRNA expression of Ghrelin in the hypothalamus was detected by RT-PCR. Immunohistochemical detection was used to detect hypothalamic Ghrelin protein expression. Results Compared with the normal control group， gastric emptying rate and small intestine propulsion rate of the model group decreased； the content of Ghrelin in the serum. and expression of Ghrelin mRNA of hypothalamus also decreased significantly； gray value of Ghrelin of hypothalamus increased significantly. Compared with the model group， the gastric emptying rate， small intestine propulsion rate， content of

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2014CB543102）；國家自然科學(xué)基金（81673886）

通訊作者：袁建菱，E-mail：jly888666@qq.com；岳增輝，E-mail：624755064@qq.com

Ghrelin in the serum， and the expression of Ghrelin mRNA of hypothalamus significantly increased in the three EA stimulationgroups， and the gray value of the hypothalamic Ghrelin significantly decreased. The effect of strong EA stimulation group was better than weak EA stimulation group and middle EA stimulation group. Conclusion EA can effectively promote bowel movement， and improve the symptoms of delayed gastric emptying of DGP rats by increasing Ghrelin content. The curative effect of strong EA stimulation group is better.

Keywords： diabetic gastroparesis； electroacupuncture； stimulation intensity； Ghrelin； rats

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病的常見慢性并發(fā)癥之一。饑餓素可促進(jìn)攝食、保護(hù)胃黏膜、加快胃排空[1-2]。研究表明，DGP胃運(yùn)動(dòng)障礙與中樞及外周饑餓素基因表達(dá)減少密切相關(guān)，DGP大鼠胃組織饑餓素含量及饑餓素mRNA表達(dá)均顯著下降[3-5]。有研究顯示，電針可有效改善DGP患者胃排空遲緩癥狀[6-8]。不同刺激強(qiáng)度是影響電針療效的重要參數(shù)，一般而言，電針刺激強(qiáng)度分為小、中、大刺激3種。本實(shí)驗(yàn)建立DGP大鼠模型，觀察電針不同強(qiáng)度對DGP大鼠血糖、胃排空、小腸推進(jìn)率及下丘腦饑餓素mRNA和蛋白表達(dá)的影響，明確電針對DGP大鼠饑餓素含量的調(diào)節(jié)機(jī)制，探討電針改善大鼠胃排空、增強(qiáng)胃動(dòng)力是否與該機(jī)制相關(guān)，以及其療效與電針強(qiáng)度的關(guān)系，為臨床治療DGP提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級SD大鼠60只，8～9周齡，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號43004700019099。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和小、中、大刺激量組，每組12只。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛，天津科密歐化學(xué)試劑公司；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma公司，批號015H1492；酚紅，天津恒興化學(xué)試劑公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Trizol，美國Invitrogen公司；檸檬酸鈉、檸檬酸，湖南匯虹試劑公司；饑餓素抗體，英國Abcam公司。華佗牌0.30 mm×25 mm針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；穩(wěn)豪倍易型血糖儀及試紙，美國強(qiáng)生公司；華佗牌SDZ-Ⅴ型電針儀，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；TGL-18R臺式冷凍離心機(jī)，德國漢堡公司；PIKO REAL 96熒光定量PCR儀，美國Thermo公司；免疫組化試劑盒，德國羅氏公司；免疫圖文分析系統(tǒng)，北航公司，MIAS-1000型；自動(dòng)顯微鏡照相系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）。

1.3 造模

造模大鼠禁食12 h，臨用前將STZ用0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.2，4 ℃）以2%濃度配制，造模大鼠按55 mmol/kg劑量經(jīng)左下腹腔內(nèi)一次性注射[9]?？瞻捉M大鼠于腹腔內(nèi)一次性注射等體積0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射后72 h取尾靜脈血，用血糖儀和血糖試紙測大鼠非空腹血糖，即刻血糖≥16.7 mmol/L者作為糖尿病大鼠?？瞻捉M大鼠予普通飼料規(guī)律喂養(yǎng)，模型組和小、中、大刺激量組大鼠予高脂高糖飼料（普通飼料∶熟豬油∶蔗糖∶奶粉∶雞蛋=58∶15∶20∶5∶2）單日上午、雙日下午不規(guī)律喂養(yǎng)[10]，連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)期間檢測隨機(jī)血糖，凡血糖<16.7 mmol/L及死亡大鼠剔除實(shí)驗(yàn)。血糖≥16.7 mmol/L及一般情況、大便性狀與空白組比較差異明顯認(rèn)為DGP模型成功[11]。

1.4 干預(yù)

穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]“動(dòng)物針灸穴位圖譜”和擬人對照法進(jìn)行選取?！白闳铩保ê笕铮┪挥谙リP(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處?！傲洪T”位于胸劍聯(lián)合到肚臍連線中點(diǎn)旁開至鎖骨中線中點(diǎn)處?！叭幗弧蔽挥诤笾珒?nèi)踝尖直上10 mm。電針各組于造模第8周末開始針刺治療。空白組和模型組將大鼠捆綁于鼠板上，不行電針，每次20 min，1次/d，連續(xù)15 d。

小刺激量組：取同側(cè)“足三里”“梁門”“三陰交”，針刺穴位得氣后施用平補(bǔ)平瀉、中等幅度、均勻的提插捻轉(zhuǎn)手法，行針1 min后接電針，波形為疏密波、頻率為20/100 Hz，電針強(qiáng)度參數(shù)為1（0.12 mA），動(dòng)物雙下肢輕微顫動(dòng)，電針時(shí)間20 min，兩側(cè)穴位交替使用，1次/d，治療后正常進(jìn)食，連續(xù)15 d。

中刺激量組：電針操作同小刺激量組，頻率為20/100 Hz，電針強(qiáng)度參數(shù)為2（0.24 mA），動(dòng)物雙下肢持續(xù)抖動(dòng)，電針時(shí)間20 min，兩側(cè)穴位交替使用，1次/d，治療后正常進(jìn)食，連續(xù)15 d。

大刺激量組：電針操作同小刺激量組，頻率為20/100 Hz，電針強(qiáng)度參數(shù)為3（0.36 mA），動(dòng)物雙下肢持續(xù)較大幅度抖動(dòng)，電針時(shí)間20 min，兩側(cè)穴位交替使用，1次/d，治療后正常進(jìn)食，連續(xù)15 d。

1.5 血糖測定

每周尾靜脈采血，血糖儀和血糖試紙測定血糖。

1.6 胃排空率測定

治療結(jié)束后第2日大鼠給予2 mL酚紅溶液灌胃，20 min后處死，取大鼠全胃。測定方法參照文獻(xiàn)[9]，計(jì)算大鼠胃排空率。胃排空率（%）=（1-實(shí)測酚紅OD值÷標(biāo)準(zhǔn)酚紅OD值）×100%。

1.7 小腸推進(jìn)率測定

將取出的小腸鋪于白紙上，測量幽門至回盲部全長及幽門至酚紅所到距離，取兩者比值即為小腸推進(jìn)率（酚紅在小腸中移行距離÷小腸全長×100%）。

1.8 血清饑餓素含量測定

大鼠麻醉腹主動(dòng)脈采血，血液標(biāo)本置于非抗凝管中，常溫靜置20 min，4 ℃、3000 r/min離心10 min，收集上清液，將上清液冷凍置于-20 ℃或-80 ℃冰箱保存。ELISA檢測饑餓素，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9 下丘腦饑餓素mRNA表達(dá)測定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定。大鼠處死后斷頭，取大鼠下丘腦。取腦組織約0.02 g，加入1 mL Trizol研磨勻漿，加三氯甲烷震蕩，離心，加等體積異丙醇靜置。低溫離心后棄上清保留沉淀，加乙醇震蕩。低溫離心，棄上清液，加無菌無酶水溶解沉淀。吸取2 μL RNA溶液運(yùn)用紫外分光光度計(jì)于波長260、280 nm處測定吸光度，計(jì)算其濃度、純度。用相對定量2-ΔΔCt法分析結(jié)果，ΔCt=各樣本目的基因Ct值-各樣本β-actin的Ct值，ΔΔCt=ΔCt-空白組Ct值。

1.10 下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)測定

采用免疫組化測定。取大鼠0.25 g下丘腦組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、過氧化氫滅活、血清封閉，添加饑餓素抗體，4 ℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的二抗及辣根過氧化酶各50 μL，室溫孵育15 min，蘇木素襯染細(xì)胞核，沖洗、封片，顯微鏡觀察。胞膜上或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色片狀或顆粒狀物為陽性反應(yīng)。高倍鏡下（400×）每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，用OLYMPUS醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析，取其平均值作為該切片指標(biāo)表達(dá)的平均灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示。組間比較采用方差分析，方差齊多重比較用LSD法，方差不齊用Tamhanes T2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

實(shí)驗(yàn)期間，空白組大鼠日常活動(dòng)正常，毛發(fā)光澤良好，精神良好，飲食飲水正常，大小便無顯著改變。造模大鼠在造模后3 d，出現(xiàn)多飲多食多尿等糖尿病癥狀；第4周開始，出現(xiàn)活動(dòng)、反應(yīng)遲緩及精神狀態(tài)欠佳等癥狀；第6周開始，出現(xiàn)形體消瘦，腹部膨隆，皮毛泛黃疏松無光澤，大便性狀改變、氣味難聞，部分大鼠出現(xiàn)感染病灶，合并眼病、四肢紅腫等。

2.2 電針對模型大鼠血糖、胃排空率、小腸推進(jìn)率的影響

與空白組比較，模型組大鼠血糖顯著升高，胃排空率及小腸推進(jìn)率顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，各針刺組血糖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各針刺組小腸推進(jìn)率及胃排空率顯著上升（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.3 電針對模型大鼠血清饑餓素含量及下丘腦饑餓素mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組血清饑餓素含量、下丘腦饑餓素 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.01），下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，小、中、大刺激量組血清饑餓素含量、下丘腦饑餓素 mRNA表達(dá)明顯升高，下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與小、中刺激量組比較，大刺激量組血清饑餓素含量、下丘腦饑餓素mRNA表達(dá)顯著升高，下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表2、圖1。

3 討論

臨床上DGP以早飽、上腹脹滿、噯氣、惡心、嘔吐等為主要表現(xiàn)。針刺刺激量可直接影響針灸臨床療效，電針的運(yùn)用能規(guī)范針刺刺激量，針刺電流強(qiáng)度是電針參數(shù)之一，是影響針效和改變針效機(jī)制的重要因素，不同電流強(qiáng)度治療效果差異明顯[13-14]。DGP病位在胃，且與脾密切相關(guān)，針刺治療選取足陽明胃經(jīng)、足太陰脾經(jīng)穴位居多[15-17]。足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴，針刺“足三里”對胃腸道的生理活動(dòng)具有雙向調(diào)節(jié)的作用，胃弛緩時(shí)可以使其收縮增強(qiáng)，胃進(jìn)展時(shí)可以變?yōu)槌诰?，從而達(dá)到治療胃腸道疾病的目的[18]。三陰交為足太陰脾經(jīng)腧穴，針刺“三陰交”可改善大鼠胃局部組織微循環(huán)并能保護(hù)胃黏膜[19]。梁門為足陽明胃經(jīng)腧穴，針刺“梁門”對大鼠胃黏膜細(xì)胞HSP70 mRNA的表達(dá)有促進(jìn)作用[20]。

饑餓素是生長激素釋放激素（GHSR）的天然配體，GHSR也廣泛存在于中樞與外周。在外周，胃組織饑餓素可與相應(yīng)的受體結(jié)合，從而增加平滑肌收縮幅度，進(jìn)一步加強(qiáng)胃腸動(dòng)力、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)功能。在中樞，饑餓素與其功能性受體GHSR-1α結(jié)合，刺激迷走神經(jīng)通路及膽堿能通路產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，促進(jìn)胃酸分泌及胃腸蠕動(dòng)，從而增加胃排空。饑餓素是GHSR的內(nèi)源性配體，其生物活性較強(qiáng)，能調(diào)節(jié)生長激素分泌、加快胃運(yùn)動(dòng)、保護(hù)胃黏膜等。饑餓素產(chǎn)生于胃黏膜的內(nèi)分泌細(xì)胞，能促進(jìn)小腸蠕動(dòng)和胃排空。研究顯示，大鼠腹腔注射饑餓素可顯著促進(jìn)胃排空，同時(shí)增強(qiáng)胃竇幽門協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)[21]。饑餓素作為一種腦腸肽，生理狀態(tài)下，胰島素、血糖的高低可影響?zhàn)囸I素的分泌；病理狀態(tài)下，饑餓素分泌出現(xiàn)紊亂。在糖尿病早期階段，糖尿病的多食和胃腸蠕動(dòng)加速，會(huì)使胃分泌的饑餓素明顯增多；在糖尿病后期階段，血漿饑餓素水平降低，這與胃腸蠕動(dòng)減慢甚至胃輕癱有關(guān)。有研究表明，伴有DGP的糖尿病患者血漿饑餓素水平比單純糖尿病患者明顯降低[22-23]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血糖、下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)均高于空白組，胃排空率、小腸推進(jìn)率及血清饑餓素含量、下丘腦饑餓素 mRNA表達(dá)均低于空白組，表明DGP模型制作成功。針刺干預(yù)后，模型大鼠胃排空率、小腸推進(jìn)率降低及血清饑餓素含量、下丘腦饑餓素mRNA表達(dá)升高，下丘腦饑餓素蛋白表達(dá)降低，并能一定程度降低DGP大鼠血糖，從而改善DGP大鼠胃運(yùn)動(dòng)緩慢癥狀，這與相關(guān)研究一致。如彭艷等[24]采用電針干預(yù)DGP大鼠，探討電針改善DGP大鼠胃運(yùn)動(dòng)的機(jī)制，結(jié)果表明，電針治療可降低DGP大鼠血糖，促進(jìn)胃排空，促進(jìn)胃竇組織饑餓素蛋白表達(dá)，從而改善大鼠胃運(yùn)動(dòng)。林亞平等[25]通過比較不同電針頻率刺激胃擴(kuò)張?zhí)弁创笫蟆白闳铩保l(fā)現(xiàn)低、高頻電針均能明顯降低胃擴(kuò)張?zhí)弁葱袨閷W(xué)評分，且高頻電針組優(yōu)于低頻電針組，可使下丘腦組織P物質(zhì)、β-內(nèi)啡肽陽性細(xì)胞數(shù)持續(xù)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大刺激量組較小、中刺激量組療效好，提示電針大刺激量組能更有效治療DGP，緩解DGP臨床不適癥狀。本實(shí)驗(yàn)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，在臨床應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)不同疾病、患者體質(zhì)、耐受性、輕重程度等綜合考慮，以選取更適宜的電針強(qiáng)度進(jìn)行治療。本實(shí)驗(yàn)通過比較電針小、中、大刺激量針刺“足三里”等穴對DGP模型大鼠胃排空的調(diào)節(jié)作用，表明電針可通過上調(diào)饑餓素含量有效改善DGP模型大鼠胃排空遲緩癥狀，且電針大刺激量療效更佳，為DGP的臨床治療方案提供一定的依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-16）

（修回日期：2017-08-31；編輯：華強(qiáng)）