刺莧和莧屬的實時熒光PCR鑒定

林曉佳，吳 姍，陳吳健，任 琰，沈旭芳

（浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016）

當外來物種在非原產地新生態(tài)環(huán)境中建立種群，進一步傳播擴散改變或威脅本地生物多樣性且?guī)硪欢ㄎ：εc影響的時候，就成為外來入侵物種（Alien invasive species）[1]。中國國土廣袤，幅員遼闊，自然地理條件復雜，無論棲息地類型還是結構均呈現多樣化的特征，幾乎適宜任何外來物種歸化[2]。植物入侵一般比動物入侵更頻繁，更常見，入侵物種數量更大，危害程度更高[3]。植物入侵意味著外來植物可能取代土著植物，導致土著植物多樣性降低，最終導致生態(tài)系統(tǒng)多樣性的改變[4]。據調查研究顯示，中國外來入侵植物約 500種，主要為菊科Compositae，豆科Leguminosae，禾本科Gramineae，莧科Amaranthaceae等，優(yōu)勢屬中較為突出的是莧科莧屬Amaranthus[1]。該屬的刺莧A. spinosus，反枝莧A. retroflexus，長芒莧A. palmeri屬于雜草，種子細小，結實量極大，且具有化感潛力[5]。刺莧原產熱帶美洲，目前中國、日本、印度、中南半島、馬來西亞、菲律賓等地皆有分布。我國19世紀30年代在澳門發(fā)現，現已成為我國熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區(qū)的常見雜草，廣布于陜西、河北、北京、山東、安徽、浙江、廣東、香港、臺灣等二十余個省市。刺莧胞果邊熟邊開裂，散落種子于土壤中，入侵曠地、園圃、農耕地等，常大量孳生危害旱作農田、蔬菜地及果園，嚴重消耗土壤肥力[6]，對生長在其周圍植物的萌發(fā)和光合速率都會有一定的影響，降低多種作物的生長和產量[5]。成熟植株有刺因而清除比較困難，并傷害人畜。2010年被我國環(huán)保部列入“中國第二批外來入侵物種名單”，成為我國第二批十種外來入侵雜草之一[6]。

入侵生物的傳播途徑主要有3種。有意識引進，即人為引進具有一定經濟價值、實用價值的物種，最后演變?yōu)槿肭址N；無意識引進，即隨著貿易、運輸、旅游等活動而傳入的物種演變而成的入侵種；自然入侵，即通過物種自身的擴散能力或者借助自然條件而實現的入侵[7]。據悉，中國外來入侵植物中約 50%是由于檢疫人員疏漏，隨貿易品、運輸工具等方式引進，即無意識引進。但隨著貿易全球化，人為活動范圍的擴大，進出口貿易量的與日俱增，對檢疫工作提出了更高的要求。而檢疫工作中面臨的業(yè)務量大、鑒定專家匱乏，特別是植物物種鑒定通常以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定為主，若植物以種子、果實等形態(tài)出現，或形態(tài)學信息不足等都會使鑒定面臨困難[8]。利用分子生物學手段，通過檢測物種DNA序列中特異性的片段，是解決形態(tài)學鑒定不足的有效方法之一，也為快速檢疫鑒定攜帶或夾帶的植物樣本或種子提供有效的解決方案。實時熒光 PCR方法是基于傳統(tǒng)PCR法的基礎上，設計具有物種特異性的引物和探針，通過特異性引物的擴增，鑒定該物種是否為目標物種，同時結合具有熒光標識的探針實現同步擴增同步檢測，提高檢測效率。本研究基于植物葉綠體基因的保守片段，研究了刺莧和莧屬植物的實時熒光PCR快速鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 供試樣品

供試植物樣品包括莧科莧屬7種（包含刺莧的9個不同地理種、長芒莧的2個不同地理種和其它5種）和莧科非莧屬8種，以及莧科外植物3種共27個樣品（表1）。2014－2015年7－8月，在浙江、江蘇及廣東等地糧庫周邊、農舍周圍、村道邊和田間等地采集相關植物樣品，每個采集地點每種樣品均隨機采集3株，將其放入塑料樣品保鮮袋中，帶回實驗室后放置于－70℃冰箱保存、備用。種子樣品是2015年從進口大豆中截獲，置于4℃冰箱中保存、備用。

表1 供試樣品Table 1 Samples for test

1.2 基因組DNA提取

每株植物樣品取2 g葉片，用液氮研磨后混勻，再取其中0.2 g；每個種子樣品隨機抽取10粒，用液氮研磨后混勻，再分別采用QIAGE N DNeasy Plant Mini Kit（美國）試劑盒提取，得到的DNA溶解在50 μL去離子水中。所得DNA樣品置于－20℃冰箱保存、備用。

1.3 特異性引物探針的設計與合成

引物和探針的設計是基于葉綠體的PsbA基因（Genbank登錄號：DQ006133.1），通過Primer 5軟件選取了ASP-1和ASP-2兩組具有刺莧特異性的引物探針（表2）。本研究所用的TaqMan實時熒光PCR引物和探針由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。

表2 引物探針序列Table 2 Primers and probes designed for detection of A. spp.

1.4 TaqMan實時熒光PCR

實時熒光PCR反應體系如下：10 μL Premix Ex Taq（Takara，中國），上游引物（10 pmol·μL-1）0.4 μL，下游引物（10 pmol·μL-1）0.4 μL，探針（10 pmol·μL-1）0.4 μL，取上述提取得到DNA液2 μL，用去離子水補足體積至20 μL。陰性對照反應用2 μL的去離子水替代DNA進行反應。應用熒光定量PCR儀lightcycle 480（Roche，美國）進行反應，反應程序為（1）95℃，10 s；（2）95℃，5 s；58～62℃（每2℃為一個梯度進行優(yōu)化），23 s；40個循環(huán)。在特異性和靈敏度驗證實驗中，real-time PCR反應都重復3次，Ct值表示結果（Ct值表示每個反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數），SD表示標準差。

1.5 引物的特異性和靈敏度驗證

1.5.1 特異性驗證 對27個樣品進行熒光PCR檢測，以驗證所設計引物探針的特異性（表3）。同時設置了3個PCR退火溫度（58℃，60℃，62℃），以比較不同溫度下的熒光PCR反應特異性。

1.5.2 靈敏度驗證 以初始濃度為6.7 ng·μL-1的衢州刺莧DNA為材料，用去離子水對上述DNA進行2倍稀釋，共得到12個濃度的DNA樣本進行熒光PCR檢測，以驗證引物探針ASP-1與ASP-2的靈敏度（表4）。其中DNA的初始濃度通過核酸濃度儀（Nanodrop 1000）測定獲得，其余樣品的濃度則通過2倍梯度稀釋推算得到[9]。

1.6 數據分析

熒光PCR反應完成后，用儀器自帶的軟件lightcycle 480 software release計算并得到Ct值。根據重復3次的Ct值，利用Excel 2007軟件計算相應的標準差（SD）。取3次結果的平均值，平均Ct值＞35.0或無Ct值可判為陰性，Ct值≤35.0可判為陽性。

2 結果與分析

2.1 引物探針特異性驗證

設計的兩組引物探針經特異性驗證后顯示，不同的擴增溫度對引物探針的特異性存在影響。58℃時，ASP-1不僅能在刺莧中擴增出相應條帶，同時也能在莧屬植物中擴增到目的片段，但當溫度提高到60℃時，特異性有所升高，當溫度設定為62℃時，只有目標物種得到陽性結果（表3）。對莧屬具有特異性的引物探針組合ASP-2而言，當擴增溫度設定為58℃時，在非莧屬植物中也出現了非特異性擴增，但當溫度設為 60℃和 62℃時，分別都只有在目標莧屬植物中得到了陽性結果，但在60℃時，得到的Ct值低于62℃時的結果，相比較60℃時檢測的靈敏度較高。因此，ASP-1適合作為刺莧的實時熒光 PCR特異性鑒定引物探針，其最佳擴增溫度 62℃；ASP-2適合作為莧屬的實時熒光PCR特異性鑒定引物探針，其最佳擴增溫度為60℃。

表3 引物探針特異性驗證Table 3 Specificity verification for the primers and probes

2.2 引物探針靈敏度驗證

驗證結果顯示（表4），當DNA濃度稀釋至0.03 ng·μL－1時，ASP-1得到的Ct值為32.2，當濃度降至0.02 ng·μL－1時，Ct值已經低于檢測限。該引物探針的靈敏度為0.03 ng·μL－1。而ASP-2的靈敏度則相對高，當檢測用DNA的濃度降低至0.01 ng·μL－1時，得到的Ct值為33.8，DNA濃度進一步降低至0.005 ng·μL－1時才出現陰性結果。

表4 引物探針靈敏度驗證Table 4 Sensitivity verification for the primers and probes

3 結論與討論

目前國內對刺莧和莧屬的研究主要集中在其形態(tài)結構、化學成分、生理生化和適生性分析，如姜建萍等研究了刺莧的顯微結構[10]；李潔運用多種色譜學方法深入而系統(tǒng)地研究了刺莧的化學成分，并依據其化學成分進行生物活性研究，從而評價刺莧的生物活性與化學成分之間的關系[11]；陶愛林等利用基因克隆技術，同時采用生物信息學軟件MULTIPREDSWISS-MODEL在線軟件對所得基因編碼蛋白進行抗原性評估及三級結構模擬[12]；黃飛龍等采用原核系統(tǒng)高效表達刺莧花粉過敏原 Prf23的條件及免疫學鑒定[13]；李妮亞等和崔聰淑等分別對刺莧種子的萌發(fā)特性和野生刺莧種子休眠特性及其發(fā)芽方法進行了研究[14-15]；朱慧等采用全挖法對粵東地區(qū)的皺果莧、刺莧、空心蓮子草Alternanthera philoxeroides 3種入侵植物在兩種不同生境下的種群構件生物量結構特征進行測量和比較[16]；鄭卉等基于包括刺莧在內的4種莧屬雜草已有的分布點數據，使用GARP和Maxent兩個模型對其在中國的適生區(qū)進行預測[17]。王秋實結合歷史標本信息和野外調查，對中國莧屬植物進行了詳細的經典分類學研究，同時對其入侵風險進行了評估[1]。而對刺莧和莧屬快速分子鑒定的研究目前尚未有報道。

目前檢疫鑒定雜草的常用分子生物學方法主要有以下幾種：限制性內切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）、隨機擴增多態(tài)性（RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、簡單重復序列（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP），以及應用較多的DNA條形碼技術。如Transue等對33個籽粒莧材料進行了RAPD解析，結果與傳統(tǒng)形態(tài)學分類吻合[18]；陳景堂等利用RAPD技術研究了亞洲和中南美洲產的莧屬植物7種14個品系遺傳關系[5]。但上述5種方法中，前4種更多的用于種屬間的聚類分析比較，較少用于對某一樣本的種屬鑒定，只有“DNA條形碼技術”則可直接用于種屬鑒定。所謂“DNA條形碼技術”就是利用1段至幾段標準的、易擴增的、種間差異顯著大于種內差異的DNA片段來鑒別物種的新技術[19]。該方法已被應用到錦葵科Malvaceae植物[20]、蒼耳屬Xanthium spp.植物[21]、毒麥屬Lolium spp.植物[22]以及銀毛龍葵Solanum elaeagnifolium[23]等的鑒定。

本研究在DNA條形碼的基礎上，比較了matK，rpoC1，rpoB，accD及PsbA等基因在莧屬內的序列異同(略)，最后在PsbA上找到了適合莧屬及屬內刺莧鑒定的引物和探針序列，建立了一種能快速、靈敏、準確地鑒定刺莧及莧屬植物的新方法——實時熒光PCR鑒定方法。該方法對刺莧的檢測靈敏度可達到0.03 ng·μL－1；莧屬的檢測靈敏度則可達到0.01 ng·μL－1，足以滿足日常鑒定的檢測需求。同時該方法從DNA抽提到獲取實時熒光PCR圖譜，整個過程可在3 h內完成，能達到快速鑒定入侵雜草刺莧和莧屬植物的目的。實時熒光PCR方法適用于植物任何生長周期和生長部位，不受實驗材料存活狀態(tài)的影響；同時可對疑似目標植物殘體進行快速準確鑒定，彌補了形態(tài)學鑒定方法的不足，可作為形態(tài)鑒定的輔助方法，可快速準確有效地對刺莧及莧屬植物進行鑒定。

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