轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米MON810轉(zhuǎn)化事件的研究及應用

楊 雙

（遼寧省沈陽市農(nóng)業(yè)科學院，沈陽 110034）

轉(zhuǎn)基因育種技術包括基因分離、基因克隆、載體構建、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化事件篩選、品種選育等環(huán)節(jié)，其核心技術是遺傳轉(zhuǎn)化，即將外源基因轉(zhuǎn)入受體基因組中。目前轉(zhuǎn)基因玉米常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法是基因槍法和農(nóng)桿菌介導法。轉(zhuǎn)化時外源基因隨機插入到受體材料的基因組中，不同的插入位點產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)化事件，因此每次轉(zhuǎn)化反應一般產(chǎn)生幾十個至上千個轉(zhuǎn)化事件。在品種選育前需要從中篩選出外源基因表達水平和表達模式符合商業(yè)化用途的轉(zhuǎn)化事件。同一個轉(zhuǎn)化事件可以通過常規(guī)雜交手段導入其他玉米材料中，進而選育出不同品種，成為某個轉(zhuǎn)化事件的品系。轉(zhuǎn)化事件不易被修飾改造而被重新申請專利，所以轉(zhuǎn)化事件具備很難繞過或者規(guī)避的技術優(yōu)勢，因此轉(zhuǎn)化事件是轉(zhuǎn)基因育種知識產(chǎn)權保護的重點，也是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中鑒定轉(zhuǎn)基因品系的關鍵[1]。目前全球被批準商業(yè)化的玉米轉(zhuǎn)化事件達148個，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米中MON810轉(zhuǎn)化事件的商業(yè)化程度最高，全球有26個國家和地區(qū)批準其用于種植或飼料食品加工。鑒于MON810在中國的專利將在2020年過期，為了進一步應用該轉(zhuǎn)化事件，本文綜述了有關MON810轉(zhuǎn)化事件的分子生物學特征、檢測方法、殺蟲效果、安全評價、國內(nèi)外應用現(xiàn)狀，供相關從業(yè)者參考。

1 MON810的分子生物學特征及檢測技術

MON810是美國孟山都公司于1993年研發(fā)成功，1996年美國批準其進行商業(yè)化種植。其外源基因來源于蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種HD-1菌種（Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki HD-1） 的Cry1Ab基因，經(jīng)基因修飾后接入質(zhì)粒載體PVZMBK07中，通過基因槍法實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。

1.1 MON810的分子生物學特征 MON810轉(zhuǎn)化事件的插入序列包含CaMV 35S啟動子（299bp）、經(jīng)修飾的抗蟲基因Cry1Ab部分編碼區(qū)域（2448bp）、玉米熱激蛋白基因hsp70的內(nèi)含子（804bp）（圖1）。在轉(zhuǎn)化前的質(zhì)粒中CaMV 35S啟動子的長度是615bp，外源抗蟲基因長度是3460bp，這是由于基因槍法轉(zhuǎn)化時外源序列會隨機產(chǎn)生斷裂。MON810事件中CaMV 35S啟動子丟失了5′端序列，但未影響其功能，能在玉米全植株和全生育期啟動外源抗蟲基因的表達。同樣，Cry1Ab基因丟失了3′端序列，3′端起到穩(wěn)定蛋白結構作用，缺失后并沒有影響其殺蟲功能。MON810的5′和3′端側翼序列長度分別為803bp和588bp的玉米基因組序列。側翼序列及插入序列全長為5.5kb，位于基因組兩個NdeⅠ酶切位點之間。

圖1 MONA810轉(zhuǎn)化事件示意圖

1.2 檢測技術 轉(zhuǎn)基因檢測技術包括篩查檢測和品系檢測，篩查檢測目的是確定是否含有外源插入序列，品系檢測是確定轉(zhuǎn)化事件。不同轉(zhuǎn)化事件的插入序列不同，而且插入序列在基因組中還可能存在位置效應，即影響相鄰基因或染色體結構，或者相鄰基因和染色體結構影響外源基因表達。因此不同的轉(zhuǎn)化事件可能存在潛在未知風險，所以每個轉(zhuǎn)化事件都需要安全評價。轉(zhuǎn)化事件的檢測是轉(zhuǎn)基因生物安全管理及進出口貿(mào)易必要程序，只有通過安全評價的轉(zhuǎn)基因事件才可以商業(yè)化。

目前轉(zhuǎn)化事件的檢測主要是根據(jù)插入序列與玉米基因組之間的連接區(qū)域設計引物，應用PCR技術擴增特異條帶，進而確認特異的轉(zhuǎn)化事件。我國目前常用的MON810轉(zhuǎn)化事件檢測標準是農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007和國家出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 1196-2012。除了上述標準外，武海斌等[2]根據(jù)MON810的3′端與基因組相連接序列設計引物，該引物可以實現(xiàn)與Bt11、TC1507及玉米內(nèi)參基因zSS Ⅱ b的特異引物進行復合PCR檢測。易小平等[3]報道了新的MON810定性PCR檢測方法，該方法的擴增產(chǎn)物長325bp，非特異擴增少，不易產(chǎn)生假陽性檢測結果，并經(jīng)過國內(nèi)7家實驗室驗證了該方法的重復性和靈敏度。陳穎等[4]建立了實時熒光定量PCR檢測技術，能夠檢測0.01%含量的轉(zhuǎn)化事件。近年來，環(huán)介導的等溫擴增技術（LAMP）應用于MON810的檢測，現(xiàn)行檢測標準是SN/T 3767.8-2014。

2 MON810的殺蟲效果及安全評價

MON810表達的殺蟲蛋白是蘇云金芽孢桿菌（Bt，Bacillus thuringiensis）的殺蟲晶體蛋白 Cry1Ab，是所有抗蟲蛋白中應用最廣泛的一種，對歐洲玉米螟、西南玉米螟和亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲都具有良好抗性[5]。該蛋白的殺蟲機制是：被昆蟲攝入后，在堿性腸道中被活化，專一性與中腸上皮細胞受體結合，形成離子通道或孔洞，引起滲透壓失衡，導致昆蟲死亡。MON810事件應用的啟動子是CAMV 35S啟動子，該啟動子屬于強啟動子，沒有組織特異性，能強制啟動外源基因在玉米各組織中表達，使整個植株都表達殺蟲蛋白，一方面全方位防治玉米螟，另一方面其安全性也倍受關注。

2.1 殺蟲效果 MON810在1996年獲得美國食品藥物管理局（FDA）、美國農(nóng)業(yè)部（USDA）和美國環(huán)保署（EPA）批準后在美國商業(yè)化。自商業(yè)化至今的20多年間，在防治玉米螟方面效果好，受到種植者歡迎。MON810對心葉期發(fā)生的一代歐洲玉米螟和對穗期發(fā)生的二代玉米螟防效都高達96%[5]。試驗結果顯示MON810對亞洲玉米螟有明顯抗性[6]。此外，MON810對玉米莖夜蛾、玉米禾螟也具有一定的控制效果[7]。MON810的玉米子粒對儲糧害蟲也有一定的控制作用，研究顯示可使印度谷螟和麥蛾的生殖能力下降[8]。MON810在生育期表達量不同，在抽絲期前呈上升趨勢，于抽絲期達到最高，之后下降；在各器官中的表達量也不同，葉片的表達量最高，依次為莖、根，在種子和花絲中的表達量很少[9]。

2.2 安全評價 在食用安全方面，中國疾病預防控制中心將MON810玉米以50%的比例摻入飼料中，飼喂大鼠90d，未見異常。MON810從1996年商業(yè)化以來，在食用安全方面未發(fā)現(xiàn)與常規(guī)玉米有差異。

在生態(tài)安全方面，玉米外源抗蟲基因能夠通過基因漂移方式轉(zhuǎn)入到同源的大芻草中，但是中國境內(nèi)沒有野生的大芻草，這方面的影響幾乎沒有。J. E. Losey等[10]在Nature發(fā)文稱Bt玉米花粉能導致帝王斑蝶幼蟲死亡，引起廣泛關注。D. E. Stanley-Horn等[11]研究顯示MON810的花粉對帝王斑蝶幼蟲存活沒有影響。研究顯示，MON810對玉米螟的天敵、非靶標害蟲和有益昆蟲都沒有顯著影響[5]。但是抗蟲玉米的種植存在對玉米螟抗性風險，這需要在種植過程中采取相應的庇護區(qū)等策略避免和延緩玉米螟進化[12]。

此外，轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因表達產(chǎn)物能夠通過根系、秸稈還田及花粉進入土壤生態(tài)系統(tǒng)，毒蛋白對土壤生態(tài)的影響也是生態(tài)安全評價的重要方面。邢珍娟等[13]研究了MON810轉(zhuǎn)基因玉米在土壤中降解動態(tài)，顯示最長的DT90（初始毒蛋白含量的90%降解所需要的時間）為368.3d。C.Mulder等[14]的研究顯示，Cry1Ab蛋白對土壤微生物群落組成有影響，但與非轉(zhuǎn)基因參照玉米相比，對土壤中的營養(yǎng)成分沒有影響。

3 MON810的應用

玉米螟是玉米生產(chǎn)上的主要害蟲，對玉米產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大，主要有歐洲玉米螟和亞洲玉米螟。歐洲玉米螟分布在歐洲、北非、西亞，據(jù)統(tǒng)計，美國因歐洲玉米螟造成產(chǎn)量損失及投入費用達10億～25億美元。亞洲玉米螟分布在東亞、東南亞及太平洋諸島，中國每年因亞洲玉米螟為害，導致玉米減產(chǎn)10%左右，大發(fā)生年份產(chǎn)量損失可達30%以上，甚至絕收[5]。轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因的應用為防治玉米螟提供了一條新途徑。MON810與BT176、BT11都是表達Cry1Ab殺蟲基因的第1代轉(zhuǎn)基因作物，都是在1996年開始商業(yè)化種植。隨著進一步的研究應用，研究人員發(fā)現(xiàn)BT176的花粉對帝王斑蝶和香芹黑鳳蝶幼蟲生長緩慢，而且BT176控制二代歐洲玉米螟和西南玉米螟效果差，在2001年取消了注冊登記，在2003年之后沒有應用。實踐證明，MON810抗蟲效果和安全性方面表現(xiàn)突出。

到2017年批準種植MON810的國家和地區(qū)有14個，批準進口作為食物的有21個，批準進口作為飼料的有18個。我國目前沒有批準任何轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化種植，只批準進口部分通過安全評價的轉(zhuǎn)化事件作為食品和飼料的加工原料，其中MON810品系轉(zhuǎn)基因玉米從2002年開始允許進口。我國在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉方面的研究和應用位居世界前列，為了進一步推進轉(zhuǎn)基因育種發(fā)展，我國2008年開始啟動實施了“轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項”，在抗蟲方面也獲得了具有自主知識產(chǎn)權的新基因。自主研發(fā)轉(zhuǎn)基因作物的費用約1.35億美元[15]，因此利用過期專利可以節(jié)省費用，加快應用速度。

孟山都公司在2000年將MON810轉(zhuǎn)化事件申請中國專利。專利管理是為了保護知識產(chǎn)權，但是為了人類能夠共享科技進步成果，一般設置20年保護期限。MON810轉(zhuǎn)化事件經(jīng)過了20多年的實踐驗證，在其專利保護期以后，可以繼續(xù)挖掘其價值且無需擔憂知識產(chǎn)權陷阱。

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