離體灌注新型去垢劑用于組織工程人工肺構建實驗

馬金輝，于 潔，喬葉薷，侯陳瑋，陳書弘，黑飛龍

急性、慢性肺損傷均可能導致終末期肺病。對終末期肺病患者來說,肺移植是唯一有效的治療方式。然而,由于供體缺乏,僅有不到20%的患者有機會進行肺移植手術,而且需要長期服用免疫抑制劑,10年的死亡率超過60%［1］。組織工程人工肺基于脫細胞肺支架,種植宿主自體細胞,在未來有望提供一種理想的供體來源［2］。灌注去垢劑法制備脫細胞肺支架,已經(jīng)被證明可以有效的去除肺內(nèi)細胞,同時最大程度的保留細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白［3］。灌注途徑主要有經(jīng)主肺動脈和經(jīng)主支氣管兩種［4］,目前,經(jīng)支氣管途徑受到越來越多的關注。本研究經(jīng)支氣管途徑灌注一種新型去垢劑制備脫細胞支架,有望提供一種簡便、有效的脫細胞方法。同時制備一種簡易的生物反應器來種植種子細胞,為細胞的有效種植奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與設備 清潔級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠18只,200～220 g,購于阜外醫(yī)院實驗動物中心,實驗通過醫(yī)院動物倫理會批準。Langendorff灌流系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司),蠕動泵(kamoer),組織勻漿儀(Roche),冷凍干燥機(Labconco),光學顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica),全自動細胞計數(shù)儀(賽默飛),HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 主要試劑 十二烷基醚硫酸鈉(sodium lauryl ether sulfate,SLES)(河北萬冶化工股份有限公司),肺泡II型上皮細胞(A549細胞,ATCC),6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)及F12K培養(yǎng)基(Sigma),DNA提取試劑盒(Qiagen),DAPI封片劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 取材與分組 18只SD大鼠,腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉溶液(150 mg/kg),麻醉滿意后快速打開胸腔,心、肺、支氣管整體切除。隨機分為3組(n＝6):正常肺組,不經(jīng)任何處理；脫細胞肺支架組(n＝6):灌注去垢劑,制備脫細胞肺支架；種植細胞肺組(n＝6):脫細胞肺支架種植A549細胞,在生物反應器中培養(yǎng)3 d。

1.3.2 脫細胞肺支架的制備 經(jīng)主支氣管插入16 G灌注頭,心肺團懸吊至langendorff操作臺。保持灌流壓力為20 cmH2O,25℃。分別灌注:①肝素化(10 U/ml)的去離子水15 min。②去垢劑:0.1%SLES溶液2 h,去離子水清洗15 min。③1%Triton X-100 10 min,去離子水清洗15 min。④1 mol/L的氯化鈉溶液1 h,去離子水清洗15 min。⑤含抗生素(青霉素G 500 U/ml,鏈霉素500 μg/ml)的 PBS清洗2 h。將制備的脫細胞肺支架置入磷酸鹽平衡鹽水(phosphate buffer saline,PBS)中,4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 脫細胞效果評價 HE染色:正常肺和脫細胞支架組織,4%的多聚甲醛固定48 h,常規(guī)脫水、包埋、切片5 μm,按常規(guī)行HE染色。光鏡下拍照。

DAPI染色:正常肺和脫細胞肺支架組織的石蠟切片,68℃,45 min,常規(guī)脫蠟至水；含DAPI的封片劑直接滴加在標本上,5 min后封片,共聚焦顯微鏡下拍照。

DNA定量檢測:正常肺組織和脫細胞支架組織,經(jīng)冷凍干燥機干燥,各稱取25 mg,剪碎,勻漿,蛋白酶K 20 μl消化過夜。按照DNA試劑盒說明書提取DNA。在分光光度計260 nm下讀取數(shù)值,計算出DNA濃度,單位為ng/mg。

1.3.4 簡易生物反應器的制作及細胞種植 自制的簡易生物反應器主要由蠕動泵、主容器和循環(huán)管路組成。通過主支氣管循環(huán)灌注培養(yǎng)基,能夠保證均勻地不停地傳輸細胞營養(yǎng)物質(zhì)。脫細胞肺支架在細胞種植前用無菌PBS液沖洗30 min。A549作為種子細胞,培養(yǎng)、提取、計數(shù),將40×106個細胞稀釋到10 ml的F12K完全培養(yǎng)基(加10%胎牛血清,1%青霉素/鏈霉素,2 mmol L-谷氨酰胺,1 mmol非必需氨基酸),用注射器把細胞經(jīng)主支氣管注入到支架內(nèi)。支架在培養(yǎng)基中靜置2 h。支架連接生物反應器,在37℃、95%O2、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基的容量約100～150 ml,循環(huán)速度設定為5 ml/min,每24 h更換1半培養(yǎng)基［5］。整個過程在無菌操作平臺進行。

1.3.5 種植效果的評價 在細胞種植3 d后,PBS沖洗肺支架,常規(guī)行HE染色、DAPI染色、DNA定量檢測。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,DNA數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為有顯著性差異,作圖采用GraphPad Prism 6軟件。

2 結(jié) 果

2.1 脫細胞過程大體觀察 正常肺灌注0.1%SLES溶液2 h后接近半透明(圖1C),全部灌注完成后,制備的脫細胞肺支架更加透明,肺內(nèi)肺泡結(jié)構清晰可見(圖1D)。整個脫細胞過程,肺的形態(tài)結(jié)構變化輕微。

圖1 脫細胞肺支架的制備

2.2 簡易生物反應器 主容器采用250 ml藍口瓶,循環(huán)管路采用一次性輸液器,藍口瓶的瓶口設有通風孔,整個循環(huán)過程可以維持一個相對無菌、封閉的環(huán)境。見圖2。

圖2 自制生物反應器

2.3 HE染色、DAPI染色觀察 正常肺內(nèi)布滿細胞(圖3A,D),經(jīng)過脫細胞后,可以看到脫細胞肺支架內(nèi)完全無殘留的細胞(圖3B),甚至無任何細胞核和細胞碎片(圖3E)。經(jīng)過種植A549細胞后,可見A549細胞在脫細胞肺內(nèi)均勻生長、浸潤(圖3C,F)。

2.4 DNA含量 DNA結(jié)果分析顯示,與正常肺相比,脫細胞肺支架內(nèi)的DNA含量顯著下降(n＝6,P＜0.01)；與脫細胞肺支架相比,種植A549細胞后的肺內(nèi)DNA含量明顯上升(n＝6,P＜0.01),但仍未達到正常肺的水平,有顯著性差異(n＝6,P＜0.01)。正常肺組(1 030.20±30.27)ng/mg,脫細胞肺支架組(38.42±2.45)ng/mg,種植細胞肺組(662.27±7.58)ng/mg,見圖 4。

圖3 HE染色(比例尺100 μm)和DAPI染色(比例尺75 μm)

圖4 DNA定量分析結(jié)果(n＝6)

3 討 論

構建組織工程人工肺首先通過脫細胞獲得無細胞的肺支架,其次為了避免排斥反應,利用宿主的骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、誘導多潛能干細胞等誘導分化為各種肺內(nèi)細胞,最后在可以維持肺的循環(huán)灌注和通氣功能,模擬肺內(nèi)環(huán)境的生物反應器內(nèi)進行培養(yǎng),形成一個具有氣體交換功能的人工肺［6］,旨在為肺移植患者提供一種器官來源,具有很大的臨床研究價值。

制備組織工程人工肺的第一步是獲得脫細胞肺支架,保留完整的生化成分、微循環(huán)結(jié)構、三維結(jié)構［7］。但是用于脫細胞的傳統(tǒng)的去垢劑如脫氧膽酸鈉(SDC)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)和3-［3-(膽酰胺丙基)二甲氨基］丙磺酸內(nèi)鹽都作用較強［8-10］,ECM 蛋白破壞嚴重［11］,使脫細胞肺支架喪失了一定的結(jié)構和功能,影響細胞化和血管化；同時,呼吸膜破壞嚴重,氣體交換能力難以維持。

SLES是一種新型去垢劑,和SDS均屬于陰離子去垢劑,頭部帶親水性負電荷,可以溶解細胞質(zhì)、細胞核、細胞膜。但是SLES含有乙氧基(C2H5O-),使得化學特性比SDS溫和。此外,SLES具有優(yōu)良的去污能力、生物降解性和低溫性能。2015年,Kawasaki首次報道了SLES用于心臟的脫細胞,顯示出很好的脫細胞效果［12］。本課題組前期對比了經(jīng)主肺動脈灌注SDS與SLES進行肺的脫細胞,結(jié)果顯示SLES不僅能有效地去除肺內(nèi)細胞,ECM蛋白保留的更加完整,皮下移植實驗顯示SLES肺支架具有更好的組織相容性和血管形成能力,對于肺臟這種結(jié)構疏松的器官可能使用SLES更加適合［13］。

langendorff系統(tǒng)已經(jīng)被證明可以有效地用于脫細胞肺支架的制備［14-15］。本研究中,筆者利用langendorff系統(tǒng)經(jīng)主支氣管對SD大鼠肺離體灌注SLES,取得了良好的脫細胞效果,HE染色、DAPI染色顯示無殘留的細胞及細胞核,DNA含量小于50 ng/mg,DNA去除率達到96.27%,完全達到了組織工程學要求［16］。有研究表明,與經(jīng)主肺動脈灌注相比,經(jīng)主氣管灌注制備的脫細胞肺支架在機械性能上也沒有統(tǒng)計學差異［17］,但是后者操作更加簡捷、DNA含量更低、毛細血管網(wǎng)絡保留的更加完整［18］,這對于維持氣血屏障的完整性和促進生物人工肺的再細胞化和功能化至關重要［19］。

生物反應器通過模擬肺臟的生理狀態(tài),使種子細胞更加有效地到達肺遠端區(qū)域,實現(xiàn)脫細胞肺支架的細胞化,體內(nèi)移植后可以避免裸支架形成血栓和呼吸膜纖維化,從而使氣體交換更加有效。筆者參考文獻［20］設計的這款簡易生物反應器,通過循環(huán)灌注培養(yǎng)基,實現(xiàn)種子細胞的黏附、增殖和遷移。可以看到A549細胞可以在脫細胞肺支架內(nèi)均勻、快速的生長、浸潤,培養(yǎng)3 d后DNA含量就達到了正常肺的64.67%。

本研究中使用的生物反應器未能提供機械通氣,與維持肺的生理狀態(tài)內(nèi)環(huán)境尚有一定差距。有研究表明,維持通氣功能可以避免肺部萎縮,有助于維持肺的順應性、抵抗力、彈力等,保證營養(yǎng)物質(zhì)灌注到肺內(nèi)毛細血管網(wǎng)絡,但是體外模擬肺實現(xiàn)通氣功能還存在巨大的挑戰(zhàn)［21］。雖然沒有提供通氣功能,但是通過循環(huán)灌注培養(yǎng)基可以實現(xiàn)人工肺的初步基本構建。最近有學者對可進行氣體交換的生物反應器進行探索,取得了一定的進展［22-23］。

本研究報道了經(jīng)支氣管途徑灌注SLES制備脫細胞肺支架的具體方法,并通過生物反應器驗證了種子細胞在這種脫細胞肺支架上的種植效果。相信,隨著組織工程學和再生醫(yī)學的不斷發(fā)展,組織工程人工肺一定能不斷完善,最終應用于臨床。

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