有氧運動對雄性肥胖大鼠生殖功能及睪丸組織TNF-α、Fas和Caspase-3 mRNA表達的影響

常 波，鄭錫明，李 晶，高 暢，孫玉霞，姚婷婷，李 歌，衣雪潔

（1．沈陽體育學院國家體育總局重點實驗室，遼寧 沈陽 110102；2．沈陽體育學院運動人體科學學院，遼寧 沈陽 110102；3．沈陽體育學院研究生部，遼寧 沈陽 110102）

近年來，國內(nèi)外患有生育障礙的患者數(shù)目急劇升高，其中肥胖導致的生殖功能低下的現(xiàn)象已引起大家的廣泛關(guān)注。最近對人類和其他物種的研究表明，長期肥胖會使雄性性腺機能減退（secondary hypogonadotropic），表現(xiàn)為雄性激素分泌不足、雌激素水平升高、精子質(zhì)量參數(shù)下降和生殖功能出現(xiàn)障礙［1－2］，但其作用的機制尚不清楚。有研究顯示肥胖引起的雄性生殖功能障礙與生精細胞凋亡關(guān)系密切，雄性動物睪丸內(nèi)生精細胞凋亡是正常的生理狀態(tài)［2］，但由于一些特殊的理化因素導致其大量凋亡，直接影響精子的生成數(shù)量和質(zhì)量。調(diào)控細胞凋亡的主要途徑有3種：死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）是介導細胞凋亡的一類蛋白水解酶，是細胞凋亡過程中的一個關(guān)鍵酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用，參與了細胞凋亡的誘導，是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分。作為死亡受體途徑中最后的公共凋亡效應因子，可引發(fā)生殖細胞程序性死亡，一旦被大量激活，凋亡就不可避免。研究發(fā)現(xiàn)肥胖可影響睪丸組織中Caspase-3的水平，進而導致生殖細胞大量凋亡。

運動作為目前公認的治療肥胖最為有效的手段之一，對雄性激素的影響還有很大的爭議，運動形式、運動量和運動強度的差異可能會帶來不同的實驗結(jié)果。有關(guān)有氧運動對緩解肥胖個體的生殖細胞凋亡的影響報道還較少，進一步研究引發(fā)的凋亡機制則更少。為此，通過施加有氧運動干預改善大鼠的肥胖狀態(tài)，并通過中樞和外周兩條途徑探討肥胖狀態(tài)下有氧運動對雄性生殖機能作用機制，力圖為揭示有氧運動影響精子質(zhì)量的機制提供實驗依據(jù)，也為探究防治肥胖引起的生殖機能低下的有效途徑提供理論參考。

1 研究對象與方法

1．1 研究對象

24只5周齡雄性SD大鼠，購于北京大學醫(yī)學部。依據(jù)北京大學動物實驗室動物倫理標準監(jiān)督執(zhí)行。飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。

1．2 實驗方法

1．2．1 肥胖模型的制備

24只SD雄性大鼠隨機分成2組，各12只，即正常飲食組（普通飼料）和高脂飲食組（高脂飼料）。分別為大鼠提供普通飼料和高脂飼料，飼養(yǎng)12周。高脂飲食組肥胖鼠建模成功后，將正常飲食組和肥胖（高脂飲食）組大鼠分別按照體重分層抽樣再各自分為兩組，即正常對照組（NC，6只）、正常飼料運動組（NE，6只）和肥胖組（OC，6只）、肥胖運動組（OE，6只）。高脂組大鼠的體重均在正常組大鼠平均體重的120%以上，肥胖建模成功［3］。

1．2．2 分組運動干預

兩組運動組（正常運動組和肥胖運動組）共進行為期8周的跑臺運動。正式運動開始前進行為期一周的適應性訓練，以減少正式實驗時的應激反應。起始時間為20 min，跑臺速度設(shè)定為26 m／min，以后每天增加10 min，逐漸增加到60 min／d為止。保持這一負荷進行8周跑臺運動，每周休息1 d。

1．2．3 樣品的取材及處理

8周運動干預結(jié)束后，在末次運動后36～40 h取材，取材前禁食12 h。麻醉處死，迅速取兩側(cè)睪丸，用生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，轉(zhuǎn)入液氮冷凍，以備實驗使用。

1．2．4 測試指標及方法

1．2．4．1 睪丸組織重量、睪丸系數(shù)與精子活率測定

1）將大鼠的雙側(cè)睪丸從陰囊中分離提取出來，電子天平上稱量：睪丸系數(shù)（%）＝（睪丸重量／體重）×100%。2）動物處死后，迅速取一側(cè)附睪置于37℃生理鹽水2 mL小燒杯中，剪碎，再加入同等濃度的鹽水，并與生理鹽水以1比1的比例混合，經(jīng)濾紙過濾后，提取濾液1 mL，加入生理常溫下的生理鹽水9 mL，混勻備用。取精子懸液中一滴放置于載玻片上，加蓋玻片后，光鏡觀察精子的活動能力。依照世界衛(wèi)生組織，觀察精子的流動狀態(tài)與形式，可把精子的活動度大致分為4個級別：1級：精子可以保持直線運動水平并且活動踴躍，觀察到活動性優(yōu)良。2級：基本可以保持直線運動，但與1級比較活動性略差。3級：精子保持直接向前運動的能力弱，只能在原處活動或旋轉(zhuǎn)運動。4級：精子無任何運動能力。實驗的每只大鼠都需要檢查大概200個精子，然后計算精子的活率：精子活率＝（1＋2＋3級精子數(shù)／1＋2＋3＋4級精子數(shù)）×100%。

1．2．4．2 組織提取和RT-PCR檢測 1）樣品RNA的提取。①將睪丸樣品從－80℃冰箱中取出，馬上在天平上進行稱重。然后在正常室溫條件下放置5 min，待其充分溶解（將實驗中所用的鑷子、剪刀、勻漿器均進行無菌消毒后用DEPC水處理）。②分離RNA。③低溫離心。④RNA沉淀。⑤清洗RNA。⑥干燥RNA。⑦溶解RNA沉淀。2）檢測樣品濃度，使用微量分光光度計。3）逆轉(zhuǎn)錄反應。依據(jù)Hiscript?IIOne Step qRT-PCR SYBR?Green試劑盒說明書，嚴格按照說明書完成整個設(shè)定步驟的實驗工作。4）引物序列：實驗中擴增引物序列，從PubMed數(shù)據(jù)庫查詢得到。引物具體序列見表1。

表1 RT-PCR反應相關(guān)引物的序列

1．2．5 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)±標準差±S）表示實驗結(jié)果。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析的Scheffe’s Post hoc comparisons test。OC、OE組采用雙因素方差分析來闡明運動和飲食干預對雄性肥胖大鼠生殖功能及睪丸組織基因表達的交互作用，檢驗標準：P＜0．05為組間差異顯著，P＜0．01為組間差異極顯著。

2 研究結(jié)果

2．1 各組大鼠體重、脂體比、睪丸重量、睪丸系數(shù)

由表2可知，通過8周的有氧運動，大鼠的肥胖情況有所減輕，睪丸系數(shù)上升，說明有氧運動可以減重，緩解了肥胖對睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，同時有氧運動對于正常狀態(tài)下機體的睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)也有明顯的改善作用。

表2 各組大鼠體重、睪丸重量、睪丸系數(shù)、脂體比情況（ˉX±S）

2．2 各組大鼠精子質(zhì)量參數(shù)

如表3所示，經(jīng)過20周高脂膳食喂養(yǎng)后的肥胖大鼠精子活性與精子數(shù)量明顯下降，說明肥胖會對生殖功能造成影響。8周有氧運動能夠較好地增強與改善正常和肥胖大鼠的精子活性，提高生殖能力。

表3 各組大鼠精子活動率的變化情況（ˉX±S）

2．3 各組大鼠睪丸組織中的TNF-α、Fas、Caspase-3 mRNA的表達

如表4和圖1所示，與正常組的大鼠相比，正常運動組的大鼠睪丸中TNF-α、Fas、Caspase-3的基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著性降低（P＜0．05）；肥胖組大鼠睪丸組織中的TNF-α、Fas、Caspase-3的基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著性升高（P＜0．05、P＜0．01、P＜0．01）。同肥胖組的大鼠相比較，肥胖運動組的大鼠睪丸組織中的TNF-α、Fas、Caspase-3基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低（P＜0．01、P＜0．05、P＜0．01）。同正常運動組相比，肥胖運動組的大鼠睪丸組織中的TNF-α、Fas、Caspase-3基因轉(zhuǎn)錄水平顯著性提升（P＜0．01、P＜0．01、P＜0．05）。

表4 各組大鼠睪丸組織TNF-α、Fas、Caspase-3 mRNA表達水平（±S）

表4 各組大鼠睪丸組織TNF-α、Fas、Caspase-3 mRNA表達水平（±S）

Fas Caspase-3 NC組組別N TNF-α 6 1±0．14 1±0．10 1±0．14 NE組6 0．81±0．14*0．86±0．08*0．82±0．12*OC組6 1．74±0．15*1．41±0．11**1．39±0．16**OE組6 1．43±0．12△△＃＃1．20±0．15△＃＃1．13±0．15△△＃

圖1 TNF-α、Fas、Caspase-3 mRNA表達水平

3 分析與討論

3．1 有氧運動對肥胖大鼠生殖功能的影響

睪丸作為雄性動物最重要的生殖器官，其發(fā)育與成熟狀況將對雄性生殖能力產(chǎn)生很大的影響［4－9］。本實驗發(fā)現(xiàn)肥胖組大鼠體重、脂體比明顯提高，前期研究發(fā)現(xiàn)肥胖組體內(nèi)血清睪酮、黃體生成素與卵泡刺激素水平明顯降低，雌二醇明顯升高［3］；睪丸系數(shù)、精子數(shù)目和精子活動率顯著降低；而肥胖運動組大鼠的體重、脂體比明顯下降。前期研究還發(fā)現(xiàn)血清睪酮、黃體生成素與卵泡刺激素的含量有顯著性升高，雌二醇明顯下降［3］；睪丸系數(shù)、精子數(shù)目和精子活動率均顯著上升，提示運動可改善睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)。運動作為一種減脂的手段，不僅能通過增加能量消耗和基礎(chǔ)代謝來降低體重，可能還會因此而改善睪丸功能。

李玲［10］在研究中發(fā)現(xiàn)肥胖使大鼠生精細胞大量下降且排列紊亂、結(jié)構(gòu)異常，同時還會影響生精功能，精子異常比率顯著高于普通組。徐慶陽［9］研究發(fā)現(xiàn)肥胖使精子數(shù)目與活動力均有下降的現(xiàn)象。臨床研究也發(fā)現(xiàn)肥胖人群存在精子數(shù)目和質(zhì)量下降、生精功能受損等現(xiàn)象［12］。肥胖造成精子質(zhì)量下降的主要原因，在于肥胖會影響下丘腦—睪丸—性腺軸（HPT）的功能，長期的高熱量攝入使得雄性機體的脂肪組織大量聚集，過量堆積的脂肪能夠通過芳香化作用使雄性激素雌性化，導致雌激素含量上升，反饋性抑制HPT軸的功能，造成生精障礙。同時體內(nèi)精子的發(fā)生與睪酮有著重要的關(guān)系。在生精小管內(nèi)維持適量的睪酮水平能夠有助于精子的產(chǎn)生與成熟。有研究表明［6］，隨著BMI的上升，男性血清睪酮的水平有下降的趨勢，同時精子密度也相應減少。

運動對機體是一種應激刺激，會引起一系列神經(jīng)－內(nèi)分泌的改變。有研究發(fā)現(xiàn)［9］，運動雖不能顯著提升睪丸的重量，但可明顯提升睪丸系數(shù)。賈斯媛［13］發(fā)現(xiàn)游泳運動會使肥胖雄性小鼠黃體生成素和卵泡刺激素顯著增加，分析可能由于運動使肥胖雄性小鼠體內(nèi)的GnRH得到良性刺激，進而促進其分泌黃體生成素和卵泡刺激素。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)［3］經(jīng)過中等負荷有氧運動后，肥胖運動組大鼠性激素水平有明顯上升，精子質(zhì)量顯著提高，提示運動使大鼠的促性腺激素釋放激素受到良性刺激，從而促進黃體生成素和卵泡刺激素的合成與釋放，進而刺激睪酮的分泌，改善了促進精子發(fā)育的激素環(huán)境，提高了精子的質(zhì)量。

3．2 有氧運動對大鼠生精細胞凋亡的影響及機制

3．2．1 肥胖對大鼠生精細胞凋亡的影響及其機制

已證實生殖細胞凋亡要借助兩大途徑：線粒體通路和死亡受體途徑，而Caspase-3作為死亡受體途徑中最后一個環(huán)節(jié)，在調(diào)控生殖細胞的凋亡上發(fā)揮了決定性的作用。目前，有關(guān)肥胖對Caspase-3的研究較少。郭銀謀［15］發(fā)現(xiàn)肥胖人群的乳腺癌組織Caspase-3的蛋白水平明顯高于正常體重組，且Caspase-3的水平與乳腺癌細胞凋亡之間存在正相關(guān)關(guān)系。本實驗發(fā)現(xiàn)，與正常組相比較，肥胖組大鼠的睪丸組織Caspase-3的水平顯著升高，精子數(shù)量明顯下降，提示肥胖可能會通過上調(diào)Caspase-3水平而增加生精細胞的凋亡。

腫瘤壞死因子（TNF-α）可激活死亡受體途徑，最終作用到Caspase-3，引發(fā)細胞凋亡。腫瘤壞死因子作為一種具有多種生物活性的細胞因子，除了脂肪組織是其主要來源外，近些年發(fā)現(xiàn)生殖細胞同樣也分泌腫瘤壞死因子，如支持細胞、圓形精子細胞等。睪丸中的巨噬細胞、生精細胞能分泌大量TNF-α，可以影響睪丸間質(zhì)細胞的睪酮生物合成過程，通過參與精子的發(fā)生與凋亡，對生殖功能產(chǎn)生影響。目前研究證實［16］適宜水平的TNF-α可以正向調(diào)節(jié)睪丸的功能，而含量過高則容易抑制睪酮的生成，明顯降低睪丸生殖細胞的生存率，從而誘發(fā)其凋亡。有關(guān)肥胖對TNF-α的影響，多數(shù)認為嚙齒類動物脂肪中TNF-α都過量表達，肥胖可以促進脂肪細胞表達釋放TNF-α。有學者［16］對單純性肥胖兒童的血液進行檢測，發(fā)現(xiàn)TNF-α水平顯著高于正常兒童。動物研究發(fā)現(xiàn)［7，15］與正常組大鼠相比較，肥胖組大鼠的TNF-α水平明顯升高，睪丸組織形態(tài)學發(fā)生改變，可能與肥胖促進TNF-α含量上升有關(guān)。本實驗研究也發(fā)現(xiàn)同正常組相比，肥胖大鼠的睪丸組織中TNF-α的基因表達水平顯著上升，同時伴有睪酮水平下降和精子的數(shù)量、活力下降。

在哺乳動物的睪丸組織中，TNF-α促進生殖細胞程序性死亡，通過誘導死亡受體信號各級因子引發(fā)細胞凋亡。最典型的死亡受體是自殺相關(guān)因子（factor associated suicide，F(xiàn)as，也稱CD95或Apo1）。1989年Yonehara等發(fā)現(xiàn)了一株單克隆抗體，可以識別一種表達于髓樣細胞、T淋巴細胞和成纖維細胞表面的未知分子，誘導多種人細胞系發(fā)生凋亡。這種新的膜分子被稱為Fas。同年，Trauth等也發(fā)現(xiàn)了一株可以誘導活化或惡性變淋巴細胞凋亡的單克隆抗體，他們將這株抗體所識別的蛋白稱為凋亡蛋白-1（Apo-1）。Fas屬于腫瘤壞死因子家族，是一個細胞表面分子，在凋亡信號轉(zhuǎn)導中起關(guān)鍵作用。

Fasl是Fas的天然受體，能夠特異性地與靶細胞上的Fas結(jié)合誘導細胞凋亡。Fas主要在胸腺及睪丸組織有所表達。有報道［19－20］若Fasl／Fas系統(tǒng)異常升高，TNF-α可通過生殖細胞膜上的Fas與其受體結(jié)合，形成能傳遞信號的三聚體。三聚體通過募集死亡結(jié)構(gòu)閾形成二聚體而發(fā)揮作用，凋亡作用明顯增強，最終通過激活Caspase-3引起生殖細胞大量凋亡，導致精子減少或發(fā)育障礙，甚至男性不育。馬?。?6］研究發(fā)現(xiàn)肥胖組大鼠睪丸組織中的Fas、Caspase-3水平顯著上升，生殖細胞凋亡率顯著升高。曹翔［19］等通過體外培育大鼠的內(nèi)皮細胞，并對其凋亡情況進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子可以提高內(nèi)皮細胞Fas的表達，在TNF-α作用下Fas表達加強，進一步誘導細胞凋亡。在免疫性睪丸炎中，TNF-α可以提高Fas表達，引發(fā)生精細胞凋亡?？梢娚臣毎a(chǎn)生的TNF-α可通過調(diào)節(jié)Fas水平從而控制其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖組大鼠的睪丸組織中FasmRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，并且與TNF-α和Caspase-3 mRNA表達的增加相一致，推測肥胖可能會通過死亡受體途徑造成生殖細胞大量凋亡。武進峰［20］等人對大鼠進行10周的高脂喂養(yǎng)，造模成功后，對實驗組大鼠的生殖細胞經(jīng)過RT-PCR和免疫組化測定后發(fā)現(xiàn)睪丸中Fas水平明顯大于對照組。李奇［17］也對肥胖大鼠睪丸中的Fas進行檢驗，發(fā)現(xiàn)同對照組進行比較，F(xiàn)asmRNA含量顯著上升。

3．2．2 有氧運動對肥胖大鼠生精細胞凋亡的影響及其機制

本研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3在正常運動組和肥胖運動組大鼠的睪丸組織中基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于對照組，同時精子的數(shù)量顯著性增加，推測8周的跑臺運動緩解了睪丸生殖功能障礙，下調(diào)Caspase-3的水平，降低精子細胞的凋亡率。有研究表明［4］，對大鼠進行12周的腳踏車運動，發(fā)現(xiàn)Caspase-3及上游的幾種促凋亡、抗凋亡蛋白水平發(fā)生了改變，凋亡程序中的關(guān)鍵因子Caspase-3下調(diào)到原來的95%。陳小燕［21］對高脂膳食大鼠施加游泳運動，發(fā)現(xiàn)與肥胖組相比，肥胖運動組的Caspase-3的基因水平顯著下降，同時大鼠的精子凋亡率明顯下降。推測8周的跑臺運動緩解了睪丸生殖功能障礙的情況，下調(diào)Caspase-3的水平，降低了精子細胞的凋亡率。

TNF-α可以誘導死亡受體途徑，最終作用到Caspase-3而影響精子細胞凋亡。有關(guān)運動對TNF-α影響的結(jié)果不盡一致。有研究表明連續(xù)高強度運動能夠使血漿TNF-α水平顯著提升。但有研究表明［1－2］持續(xù)鍛煉會使肥胖個體TNF-α水平明顯下降。陳小燕發(fā)現(xiàn)［21］10周漸增游泳運動的大鼠與普通安靜組相比，血清中的TNF-α水平降低。畢業(yè)［16］和胡玉龍［9］的研究也得到了類此結(jié)果。但是目前對于肥胖狀態(tài)下有氧運動對睪丸組織內(nèi)的TNF-α的基因表達研究尚少。本研究結(jié)果顯示正常運動組與肥胖運動組相比，睪丸組織中的TNF-α的mRNA基因表達較低；正常運動組TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平要比正常組低；肥胖運動組的TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平較肥胖組顯著下降，精子質(zhì)量顯著提升。

大量研究顯示［13－14］有氧運動可以降低睪丸組織中的TNF-α水平。但是有關(guān)運動對Fas轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)結(jié)果還不一致。有報道證實［10］一次性力竭運動能夠使大鼠FasmRNA水平增加，從而使生殖細胞凋亡率顯著上升。李奇［17］對肥胖大鼠施加有氧運動干預后，發(fā)現(xiàn)睪丸中Fas水平明顯下調(diào)的同時，終末剪切酶Caspase-3含量也有所降低，檢驗后發(fā)現(xiàn)睪丸組織中生精細胞凋亡率顯著下降。Caspase-3水平的降低減輕了其對生殖細胞凋亡的促發(fā)作用。本研究結(jié)果顯示與正常組和肥胖組相比，正常運動組和肥胖運動組睪丸TNF-α、Fas、Caspase-3 mRNA水平都明顯下降，精子數(shù)量增加，改善了睪丸生殖細胞大量凋亡的現(xiàn)象。提示有氧運動可以降低死亡受體途徑各級因子水平，減少對細胞凋亡最重要的終末剪切酶的促發(fā)作用，緩解了肥胖引起的生精細胞凋亡和雄性生殖功能障礙。

4 結(jié)論

1）飲食性肥胖可通過上調(diào)睪丸TNF-αmRNA表達，啟動死亡受體途徑的信號轉(zhuǎn)導，抑制睪丸的發(fā)育，對雄性生殖功能造成負面影響。

2）長期有氧運動可降低TNF-αmRNA表達，抑制死亡受體途徑的信號轉(zhuǎn)導，改善肥胖雄性大鼠對睪丸功能的負面影響，提升了正常雄性大鼠的生殖功能。

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