百里醌通過磷酸化p38MAPK途徑介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性作用的機制研究

陳子盛,廖小雯,張亦飛,肖靖華,陳 蕓,劉清霞,王 鵬,車鵬彪,朱連雨,田東波

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院 呼吸二病區(qū),廣東 清遠(yuǎn),511500; 2.廣東省五邑中醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,廣東 江門,529000)

肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一，研究[1]表明2012年全球新發(fā)肺癌患者1.82/百萬，死亡1.59/百萬，肺癌約占所有腫瘤相關(guān)性死亡的18%。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%～85%,Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC單純根治術(shù)后5年存活率約70%,而晚期NSCLC 5年存活率<5%[2]。目前中國晚期NSCLC除針對驅(qū)動基因精準(zhǔn)靶向治療，最常用一線化療是含鉑兩藥方案，即長春瑞濱、吉西他濱、多西他賽、紫杉醇、替吉奧聯(lián)合鉑類，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、治療失敗的NSCLC,通常是對以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案不應(yīng)答或耐藥[3],因而急需尋找新治療方法，以降低一線方案耐藥或提供有效穩(wěn)定新靶點。

百里醌(TQ))是黑種草籽(Nigella damascena)揮發(fā)油的主要生物活性成分，有研究[4-5]表明TQ具有抗炎、抗氧化、抗高血壓、抗菌、抗哮喘、抗腫瘤等功效,TQ能抑制乳腺癌、白血病、黑色素瘤、結(jié)腸癌、宮頸癌、多耐藥卵巢癌、前列腺癌細(xì)胞增殖，且減少順鉑化療方案不良反應(yīng)如心肌損傷[6],并對正常細(xì)胞具有較高劑量耐受性[7],提示TQ具有較好安全性，有望成為NSCLC治療選擇。本研究探討TQ對NSCLC毒性作用的分子機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞培養(yǎng)

SK-MES-1、95-D肺鱗癌細(xì)胞和A549肺腺癌細(xì)胞，均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)，TQ(純度≥98%)、U0126和SB203580均購自Sigma,實驗所需抗體p-p38、p38，p-ERK1/2、ERK1/2，p-JNK、JNK,β-actin均購自Cell Signaling Technology，化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Millipore。SK-MES-1、95-D、A549培養(yǎng)條件均為: DMEM培養(yǎng)基(高糖，含10%胎牛血清，不加雙抗),5%CO2,37.0 ℃。

1.2 實驗設(shè)計及分組

采用DMSO溶解TQ后配成100 mmol/L,按梯度稀釋法配成工作液濃度，對照組加入同體積的DMSO。

1.3 MTT測細(xì)胞毒性

SK-MES-1、95-D、A549細(xì)胞接種于96孔板,5 000個/孔，細(xì)胞貼壁后同步化12 h,分別加20、40、60、80、100 μmol/L的TQ，每個濃度設(shè)6復(fù)孔，孵育24 h后吸掉培養(yǎng)基，每孔加PBS稀釋的1×MTT液100 μL培養(yǎng)4 h,棄上清，每孔加100 μL DMSO，震蕩使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm測吸光度OD值，細(xì)胞存活率%=OD實驗組/OD對照組×100%,利用excel回歸方程計算TQ的IC50值。SK-MES-1時間依賴性實驗細(xì)胞接種密度同上，予約TQ IC50濃度分別作用10 min、24 h、48 h,MTT檢測方法如上計算細(xì)胞存活率。

1.4 Western blot實驗

將指數(shù)生長期的SK-MES-1細(xì)胞接種于10 cm2培養(yǎng)皿，密度為1.5×106個/皿，貼壁后同步化12～16 h，處理組予10 μmol/L的U0126預(yù)處理1 h后加入TQ孵育30 min，對照組予DMSO處理，提取總蛋白，采用BCA法測樣品總蛋白濃度，按Western blot實驗方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封膜，一抗為羊抗兔p-p38、p38,p-ERK1/2、ERK1/2，p-JNK、JNK，4℃孵育過夜或者室溫1 h，TBST清洗后室溫下兔二抗孵育30 min，最后利用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影并采集圖像。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度TQ對NSCLC細(xì)胞毒性作用

分別予20、40、60、80、100 μmol/L TQ孵育SK-MES-1細(xì)胞24 h,可見TQ呈濃度依賴性發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，通過Excel回歸方程式計算,TQ IC50≈66 μmol/L,予60 μmol/L TQ分別作用10 min、24 h、48 h,可見TQ呈時間依賴性發(fā)揮細(xì)胞毒性作用(圖1A、B),擴展至95-D和A549細(xì)胞，同樣觀察到TQ呈濃度依賴性降低細(xì)胞存活率(圖1C、D)。

A.TQ呈濃度依賴性發(fā)揮SK-MES-1細(xì)胞毒性作用,***P=0.000;

B.TQ呈時間依賴性發(fā)揮SK-MES-1細(xì)胞毒性作用,***P=0.000;

C.TQ呈濃度依賴性發(fā)揮95-D細(xì)胞毒性作用,***P=0.000;

D.TQ呈濃度依賴性發(fā)揮A549細(xì)胞毒性作用,*P<0.05,**P<0.01。

圖1不同濃度TQ對NSCLC的細(xì)胞毒性作用

2.2 TQ通過p38途徑介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性作用

為驗證TQ是否通過p38途徑介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性作用，對照組予30和60 μmol/L TQ作用于SK-MES-1 1h; 實驗組分別予10 μmol/L U0126和10 μmol/L SB203580預(yù)處理1 h后，分別加入30和60 μmol/L TQ 1 h,吸掉含藥培養(yǎng)基，加正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后行MTT檢測。結(jié)果表明,30 μmol/L TQ和10 μmol/L U0126+30 μmol/L TQ比較其細(xì)胞存活率有顯著差異(P=0.000)，但與10 μmol/L SB203580+30 μmol/L TQ比較無差異(P=1.00)，10 μmol/L SB203580+30 μmol/L TQ與10 μmol/L U0126+30 μmol/L TQ組比較有顯著差異(P=0.000); 隨著TQ濃度增加，60 μmol/L TQ、10 μmol/L U0126+60 μmol/L TQ、10 μmol/L SB203580+60 μmol/L TQ組兩兩比較，其細(xì)胞存活率均無顯著差異(P>0.05)，表明即使低劑量TQ狀態(tài)下,ERK抑制劑U0126也不能阻斷TQ的細(xì)胞毒性作用，即TQ不是通過活化ERK1/2起效，但p38抑制劑SB203580則明顯降低TQ的細(xì)胞毒性作用，表明TQ可快速(1 h)通過p38途徑介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，可是隨TQ濃度升高接近IC50值,SB203580短暫抑制不能明顯保護(hù)SK-MES-1(圖2)。

予10 μmol/L SB203580預(yù)處理95-D細(xì)胞1 h后，分別加入按梯度稀釋的5～40 μmol/L TQ孵育1 h,換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。10 μmol/L SB203580+40 μmol/L TQ組為10 μmol/L SB203580預(yù)處理1 h,加40 μmol/L TQ(≈95-D的TQ IC50值)孵育1 h后，更換含10 μmol/L SB203580的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。MTT結(jié)果表明，隨TQ濃度增加,SB203580對95-D細(xì)胞保護(hù)作用逐漸減弱,10 μmol/L SB203580+40 μmol/L TQ組與40 μmol/L TQ組比較其細(xì)胞存活率仍有顯著差異(P=0.033),表明持續(xù)p38抑制仍能明顯降低TQ對95-D細(xì)胞毒性作用(圖3)。

?P=0.016, ???P=0.000。圖2 TQ透過p38介導(dǎo)SK-MES-1細(xì)胞毒性作用

?P=0.033。圖3 TQ通過p38途徑介導(dǎo)95-D細(xì)胞毒性作用

2.3 TQ對NSCLC細(xì)胞毒性作用的分子機制

Western blot結(jié)果表明U0126能顯著抑制ERK1/2磷酸化,p38隨TQ濃度增加而磷酸化增加，但ERK1/2磷酸化減少,JNK磷酸化無明顯變化，表明TQ通過磷酸化p38介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，而不是ERK1/2(圖4)。

圖4 TQ對NSCLC細(xì)胞毒性作用的分子機制

3 討 論

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，刺激信號如生長因子、細(xì)胞因子、射線、基因毒性化療藥、應(yīng)激、滲透壓等均可激活MAP3K,產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)，活化MAPK(ERK、JNK/SAPK、p38),MAPK一旦被胞外刺激信號激活將廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、分化和衰老[8]。許多化療藥需激活p38才能發(fā)揮作用，通過重新激活p38誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是治療NSCLC的重要途徑之一[9],p38活化增強化療敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，引起癌細(xì)胞周期停滯，抑制癌細(xì)胞生長和分化[10],比如在乳腺癌細(xì)胞中環(huán)磷酰胺、結(jié)腸癌細(xì)胞中奧沙利鉑均通過活化p38通路而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[11-12],依托泊苷增加NSCLC細(xì)胞MKK3/6-p38的磷酸化[13],活化的p38通過滅活Met受體增強順鉑化療敏感性[14]。

TQ具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效，本研究表明TQ呈濃度及時間依賴性發(fā)揮NSCLC細(xì)胞毒性作用。為進(jìn)一步驗證TQ是否通過p38途徑介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性效應(yīng)，予10 μmol/L U0126和10 μmol/L SB203580預(yù)處理SK-MES-1,抑制ERK1/2和p38磷酸化，加入30 μmol/L TQ后孵育1 h后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,結(jié)果表明U0126并不能防止TQ對SK-MES-1的毒性作用，但SB203580卻對SK-MES-1有保護(hù)作用，其細(xì)胞存活率與正常組比較無顯著差異，表明TQ可能通過磷酸化p38介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，但當(dāng)TQ濃度接近IC50值時(60 μmol/L),10 μmol/L SB203580+60 μmol/L TQ組與10 μmol/L U0126+60 μmol/L TQ、60 μmol/L TQ組細(xì)胞存活率比較均無顯著差異，表明當(dāng)TQ達(dá)到一定濃度時,SB203580短時間抑制p38不再能阻斷TQ毒性作用。對95-D予接近IC50值的TQ濃度40 μmol/L作用1 h后，更換含10 μmol/L SB203580的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,與40 μmol/L TQ組比較，細(xì)胞存活率顯著增加，表明持續(xù)p38抑制明顯降低TQ對NSCLC細(xì)胞毒性作用。

進(jìn)一步探討TQ對NSCLC細(xì)胞毒性作用的分子機制，結(jié)果表明p38隨TQ濃度增加而磷酸化增加，但ERK1/2磷酸化減少，而JNK磷酸化無明顯改變，表明TQ透過磷酸化p38介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，同時抑制ERK1/2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖信號，并非

如Yang J等[15]表明TQ通過磷酸化ERK1/2抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

綜上所述,NSCLC細(xì)胞基本不表達(dá)p-p38,一旦其p38磷酸化，即可誘發(fā)NSCLC細(xì)胞毒性級聯(lián)反應(yīng),TQ在短時間內(nèi)(1 h)就能決定24 h后NSCLC細(xì)胞的存亡，同時抑制ERK1/2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖信號。由此可見,TQ是一種極有前景、值得繼續(xù)深入探討的備選抗癌藥或者輔助化療增敏藥。

[1] Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide: sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5): E359-386.

[2] Scrima M,Zito Marino F,Oliveira D M,et al.Aberrant Signaling through the HER2-ERK1/2 Pathway is Predictive of Reduced Disease-Free and Overall Survival in Early Stage Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients[J].Journal of Cancer,2017,8(2): 227-239.

[3] Ravdin P M,Davis G.Prognosis of patients with resected non-small cell lung cancer: impact of clinical and pathologic variables[J].Lung Cancer,2006,52(2): 207-212.

[4] Dastjerdi M N,Mehdiabady E M,Iranpour F G,et al.Effect of Thymoquinone on P53 Gene Expression and Consequence Apoptosis in Breast Cancer Cell Line[J].International journal of preventive medicine,2016,7: 66-74.

[5] Effenberger-Neidnicht K,Schobert R.Combinatorial effects of thymoquinone on the anti-cancer activity of doxorubicin[J].Cancer chemotherapy and pharmacology,2011,67(4): 867-874.

[6] Adali F,Gonul Y,Kocak A,et al.Effects of thymoquinone against cisplatin-induced cardiac injury in rats[J].Acta cirurgica brasileira,2016,31(4): 271-277.

[7] Abdelfadil E,Cheng Y H,Bau D T,et al.Thymoquinone induces apoptosis in oral cancer cells through p38beta inhibition[J].The American journal of Chinese medicine,2013,41(3): 683-696.

[8] Sui X,Kong N,Ye L,et al.p38 and JNK MAPK pathways control the balance of apoptosis and autophagy in response to chemotherapeutic agents[J].Cancer Lett,2014,344(2): 174-179.

[9] Olson J M,Hallahan A R.p38 MAP kinase: a convergence point in cancer therapy[J].Trends Mol Med,2004,10(3): 125-129.

[10] Cuadrado A,Nebreda A R.Mechanisms and functions of p38 MAPK signalling[J].Biochem J,2010,429(3): 403-417.

[11] Pang H,Cai L,Yang Y,et al.Knockdown of osteopontin chemosensitizes MDA-MB-231 cells to cyclophosphamide by enhancing apoptosis through activating p38 MAPK pathway[J].Cancer Biother Radiopharm,2011,26(2): 165-173.

[12] Chiu S J,Chao J I,Lee Y J,et al.Regulation of gamma-H2AX and securin contribute to apoptosis by oxaliplatin via a p38 mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in human colorectal cancer cells[J].Toxicol Lett,2008,179(2): 63-70.

[13] Tsai M S,Weng S H,Chen H J,et al.Inhibition of p38 MAPK-dependent excision repair cross-complementing 1 expression decreases the DNA repair capacity to sensitize lung cancer cells to etoposide[J].Mol Cancer Ther,2012,11(3): 561-571.

[14] Lou X,Zhou Q,Yin Y,et al.Inhibition of the met receptor tyrosine kinase signaling enhances the chemosensitivity of glioma cell lines to CDDP through activation of p38 MAPK pathway[J].Mol Cancer Ther,2009,8(5): 1126-1136.

[15] Yang J,Kuang X R,Lv P T,et al.Thymoquinone inhibits proliferation and invasion of human nonsmall-cell lung cancer cells via ERK pathway[J].Tumour biology: the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine,2015,36(1): 259-269.