牛糞堆肥過程中土霉素降解及其與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系

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(黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

0 引 言

我國是養(yǎng)殖業(yè)大國，集約化養(yǎng)殖發(fā)展迅速。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截止到2015年年底我國大牲畜飼養(yǎng)量約為1.2億頭，所產(chǎn)生的畜禽糞便高達(dá)2.5億噸[1-2]。大量產(chǎn)生的畜禽糞便如果處理不當(dāng)會(huì)嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境[3]。

近年來在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，為了預(yù)防和治療動(dòng)物疾病而大量使用抗生素[4]。2013年我國年抗生素使用量高達(dá)16萬噸，其中獸用抗生素占比達(dá)52%[5]。與發(fā)達(dá)國家相比，我國的抗生素使用量是美國等發(fā)達(dá)國家的5倍之多[6]。由于抗生素大多屬于水溶性，在家畜腸道內(nèi)的吸附利用率低，導(dǎo)致30%～90%的抗生素最終以母體的形式被排出到環(huán)境中[7-9]。這些抗生素在環(huán)境中長期積累導(dǎo)致耐藥基因的產(chǎn)生，造成生態(tài)污染[10]。而且，畜禽糞便的處理不當(dāng)以及抗生素的大量殘留對(duì)生態(tài)環(huán)境造成復(fù)合污染。在眾多抗生素中，土霉素是目前作為獸用抗生素最為廣泛的四環(huán)素類抗生素，我國每年由養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的糞便中，抗生素殘留量高達(dá)2 170 t[11]，其所產(chǎn)生的污染亟待解決。堆肥化處理不僅可以有效解決畜禽糞便污染問題，同樣也可有效地降低抗生素含量[12-16]。目前對(duì)于抗生素在堆肥過程中的降解研究主要集中在抗生素的降解動(dòng)力學(xué)方面[13-14,17-19]，以及在抗生素污染環(huán)境中分離抗生素降解菌等方面[20-22]，而在堆肥過程中抗生素降解與微生物多樣性方面的研究較少。馬駿[23]通過Biolog微平板法研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素會(huì)在堆肥高溫期抑制微生物活性，而在腐熟期活性恢復(fù)。Su[24]研究利用定量PCR和16S rRNA發(fā)現(xiàn)在污泥堆肥中放線菌門在堆肥后期屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種。此外溫度普遍被認(rèn)為是影響抗生素降解的主要因素[25-26]，而堆肥體系中復(fù)雜的微生物生境常被忽視。

本研究系統(tǒng)地分析了堆肥過程中土霉素的降解對(duì)微生物群落的影響，明確堆肥過程中土霉素降解與微生物群落變化之間的關(guān)系，找到優(yōu)勢(shì)微生物菌群，并通過相關(guān)性分析溫度的影響，在減少土霉素殘留造成生態(tài)污染的同時(shí)，為進(jìn)一步解釋土霉素生物降解機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)原料所用新鮮牛糞購置于大慶市臥里屯奶牛場，柳樹葉采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校園落葉，通過液相色譜檢測均不含土霉素。土霉素(25萬單位)，購于大慶福斯特藥店，理化參數(shù)如表1所示。

表1 牛糞堆肥原料的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of cattle manure composting materials

1.2 堆肥體系的建立

將牛糞與柳樹葉按照體積比1∶1混合均勻，調(diào)節(jié)C/N為25～30之間，含水70%左右。根據(jù)土霉素初始含量設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)，即對(duì)照組(CK)：土霉素初始含量為0，處理組(TG)：土霉素初始含量為60 mg·kg-1，每組3個(gè)重復(fù)。制成下體直徑1.2 m，高0.8 m的堆體，堆制周期共進(jìn)行63 d。

1.3 堆肥樣品采集及理化參數(shù)測定

堆置周期內(nèi)，每天對(duì)堆體溫度進(jìn)行測定，分別測定堆肥深層、中層和表層不同位置溫度，取平均溫度作為當(dāng)天堆體溫度，同時(shí)對(duì)環(huán)境溫度進(jìn)行測定。根據(jù)堆體溫度變化，分別在第0、3 d、7 d、14 d、28 d及63 d從堆體中不同深度采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣，混合均勻后，將堆肥樣品加等體積PBS緩沖液(pH=7.02)放置于-20 ℃保存，用于微生物等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目分析。

1.4 土霉素含量測定

土霉素含量測定采用高效液相色譜-質(zhì)譜連用法進(jìn)行檢測。液相色譜色譜柱采用Innoval ODS-2(150×4.6 mm，5 μm)不銹鋼柱，流動(dòng)相為乙腈∶水(含0.1%甲酸)(3∶7，V/V)，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL·min-1。質(zhì)譜儀噴霧電壓為3.5 Kv，輔助氣壓10 arb，毛細(xì)管溫度為300 ℃，碎裂能量CID 35%，分別采用監(jiān)測離子m/z 461-m/z 426、m/z 461-m/z 443進(jìn)行定性以及定量分析。

1.5 樣品高通量測序

分別取堆肥原料、堆肥高溫期(14 d)以及堆肥腐熟期(63 d)樣品作為堆肥典型時(shí)期樣品用于分析微生物多樣性變化。每個(gè)樣品稱取0.2～0.5 g，采用改良的氯苯法對(duì)樣品總DNA進(jìn)行提取[26]。所提取的DNA樣品經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳用于檢測DNA完整性，使用Nanodrop 2000c(Thermo Fisher Scientific,American)進(jìn)行濃度檢測，所測OD260/280在1.8～2.2之間，濃度大于10 ng·ul-1，總量大于500 ng，凝膠電泳圖譜顯示主帶清晰。將提取合格的DNA樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行建庫測序。

1.6 微生物多樣性分析

測序數(shù)據(jù)的獲取及分析：利用Qiime(version 1.9.0)對(duì)原始序列進(jìn)行過濾處理，所有優(yōu)質(zhì)序列，隨后利用Usearch(version 8.0)去除所得嵌合體已獲得有效序列。

OTU聚類：利用Qiime中cd-hit方法對(duì)所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%相似度為閾值將序列聚類成OTU，同時(shí)選取OTU的代表序列，并去除其中的singleton(所有樣品中只有一條序列的OTU)。

物種注釋：利用RDP Classifier(version 2.0)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種注釋分析。

Alpha多樣性分析：利用Qiime對(duì)ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simposn指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程中溫度變化

整個(gè)堆肥過程中TG和CK溫度變化趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)先迅速升高隨后下降的趨勢(shì)，見圖1。在堆肥前期，兩組實(shí)驗(yàn)溫度迅速升高至50 ℃以上，并分別持續(xù)了16 d和18 d。兩組實(shí)驗(yàn)最高溫均出現(xiàn)在第7 d，其中TG最高溫度為62.0 ℃，CK最高溫度為61.5 ℃，隨后溫度下降并趨于穩(wěn)定。

圖1 堆肥過程中溫度變化Fig.1 Temperature changes during composting

2.2 堆肥過程中土霉素含量變化

土霉素降解率隨堆肥的進(jìn)行呈上升趨勢(shì)，在高溫期時(shí)土霉素降解速率最快，堆肥后期趨于平緩，見圖2。堆肥前14 d共降解了68.3%的土霉素，截止到堆肥結(jié)束時(shí)，土霉素檢出量為2 mg·kg-1，土霉素去除率為96.7%。

2.3 堆肥過程中微生物群落多樣性分析

實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同溫度共采集5個(gè)樣品的DNA，經(jīng)高通量測序共獲得 732 409對(duì)原始序列，經(jīng)雙端拼接、過濾后共產(chǎn)生573 931條優(yōu)質(zhì)序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生114 786條。全部測序按相似度97%聚類分析中共得到896個(gè)OTUs，分屬于17個(gè)細(xì)菌門，43個(gè)綱，84個(gè)目，168科，341個(gè)屬，單樣品信息見表2。

圖2 堆肥過程中TG處理組土霉素變化情況Fig.2 Oxytetracycline changes with TG treatment during composting

表2 樣品測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of sample sequencing data

注：Material為原料樣本；CK 14和CK 63分別為空白組高溫期及腐熟期樣本；TG 14和TG 63為土霉素處理高溫期及腐熟期樣本。

Note: Material was the sample of raw materials;CK 14 and CK 63 as the sample of blank group at high temperature stage and maturity stage,respectively;TG 14 and TG 63 for oxytetracycline treatment group at high temperature stage and maturity stage,respectively.

基于α多樣性分析各樣品間物種豐富度和多樣性指數(shù)，其中ACE和Chao用來估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目的指數(shù)，ACE和Chao指數(shù)越大，說明OTUs越高，見表2。在本研究中，各樣品按ACE和Chao排序依次為CK 14>TG 14>CK 63>TG 63>Material，說明CK 14 OTUs最高，這也驗(yàn)證了OTUs所得到的結(jié)果。在微生物多樣性方面，從Shannon中可以發(fā)現(xiàn)，在堆肥高溫期(CK 14及TG 14)微生物多樣性高于堆肥腐熟期(CK 63及TG 63)。

2.4 堆肥過程中細(xì)菌菌群分布及比較

基于高通量測序技術(shù)，通過物種注釋，在門的分類水平上5個(gè)樣本共檢測到17個(gè)細(xì)菌門，其中變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)在所有樣本中均為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(圖3a)，這些細(xì)菌門相對(duì)豐度之和在所有樣本中均占比90%以上，在原料中占比高達(dá)99%。

整個(gè)堆肥過程，在土霉素處理中變形菌門、厚壁菌門以及擬桿菌門較空白組相比，變化趨勢(shì)明顯不同。變形菌門在原料中占比42.9%(圖3a)，屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，隨堆肥進(jìn)行，在沒有土霉素的空白組中呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，截止到堆肥63 d其相對(duì)豐度為46.0%，而在土霉素污染脅迫下(TG組)，變形菌門趨勢(shì)與之相反，由初始的42.9%下降到高溫期的37.5%，盡管在堆肥腐熟期土霉素污染減弱(2 mg·kg-1)，其相對(duì)豐度仍繼續(xù)下降至23.0%，喪失了其優(yōu)勢(shì)菌群的地位。反觀厚壁菌門可以清楚的發(fā)現(xiàn)，在沒有土霉素堆肥過程中，厚壁菌門的生長呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由初始的21.9%下降到堆肥腐熟時(shí)12.9%，而在土霉素污染脅迫下，厚壁菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，截止到堆肥腐熟期，其相對(duì)豐度為40.5%，成為主要優(yōu)勢(shì)菌群。擬桿菌門在空白組中相對(duì)豐度由初始的9.44%上升到高溫期的17.6%，隨后穩(wěn)定在17%，而在高土霉素污染下(高溫期)其相對(duì)豐度下降，由初始的9.44%下降到7.62%，當(dāng)土霉素污染減弱時(shí)(腐熟期)，其相對(duì)豐度又出現(xiàn)上升，其豐度為15.7%，見圖3a。

盡管變形菌門在高土霉素濃度下表現(xiàn)出低耐受性，但在變形菌門中假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、水微菌屬(Aquamicrobium)、Chelatococcus及Luteimonas等細(xì)菌屬在高土霉素濃度下相對(duì)豐度上升(圖3b)。其中水微菌屬、Chelatococcus以及假黃色單胞菌屬在高濃度土霉素條件下上升明顯，分別由初始的1.11%、0、0上升到6.02%、6.41%、2.38%，但隨土霉素的降解，在堆肥腐熟期時(shí)，這三種菌相對(duì)豐度明顯下降，且低于空白組見圖3b。

圖3(a) 門水平上主要微生物類群(相對(duì)豐度>5%);(b) 變形菌門屬水平上豐度上調(diào)主要微生物類群Fig.3(a) Major microbial groups at phylum level(relative abundance of >5%);(b) Major up-regulated microbial groups at proteobacteria level

在屬的水平上5個(gè)樣本共有341個(gè)屬被鑒定，其中在可注釋到的微生物中，豐度大于1%的共含有43個(gè)不同的細(xì)菌屬，見圖4a。隨堆肥進(jìn)行，在高溫期14 d時(shí)，類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、Thermobacillus、芽孢桿菌(Bacillus)在內(nèi)的部分細(xì)菌屬表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)(圖4b，表3)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，由初始的0.04%、0、0上升至4.25%、1.68%和1.16%，而在沒有土霉素處理的空白組中其相對(duì)豐度仍保持在較低水平(相對(duì)豐度<0.1%)。在原料中占比較大的動(dòng)性微菌屬(Planomicrobium)和Arthrobacter在高溫期兩組實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，見圖4b，表3。

2.5 基于土霉素降解相關(guān)性分析

為了探究溫度、不同微生物類群與土霉素降解之間相關(guān)性，以土霉素處理組為研究樣本，采用Correlation coefficient分析溫度(非生物因素)、微生物類群和土霉素降解之間相關(guān)系數(shù)(表4)，從表中我們可以發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)和Chelatococcus與土霉素降解之間表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，隨后是溫度(非生物因素)、水微菌屬、假黃色單胞菌屬及Thermobacillus等，而動(dòng)性微菌屬、Arthrobacter和Luteimonas表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖4(a) 屬水平上主要微生物類群(相對(duì)豐度>1%);(b) 土霉素處理組中主要變化微生物類群Fig.4(a) Major microbial groups at genus level(relative abundance of >5%);(b)Major microbial groups in oxytetracycline treated group

表3 屬水平上主要差別細(xì)菌屬Table 3 The major microbial difference at genus level

表4 溫度以及不同微生物類群與土霉素降解之間相關(guān)性Table 4 Correlations between temperature,different microbial groups and terramycin degradation

3 討 論

Wang等[19]在研究糞便及土壤中土霉素降解中，通過繪制一級(jí)動(dòng)力學(xué)降解曲線證明，隨溫度的升高，土霉素降解速率加快，整個(gè)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)最高溫度為45 ℃。本研究發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥過程中，最高溫度達(dá)到50℃以上，而且堆肥高溫期土霉素降解速率最大，因此，堆肥所產(chǎn)生的高溫可能會(huì)加速土霉素的降解。Arikan等[14]在研究堆肥過程中土霉素降解時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)熱降解是土霉素降解的關(guān)鍵因素。在本研究中，通過分析溫度、不同微生物類群與土霉素降解之間相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬、短芽孢桿菌屬及Chelatococcus等細(xì)菌屬對(duì)土霉素降解過程具有較大的響應(yīng)，說明土霉素在熱降解的同時(shí)，微生物驅(qū)動(dòng)的生物降解也可能表現(xiàn)出較強(qiáng)的作用，這可能是堆肥過程中土霉素降解的另一個(gè)關(guān)鍵因素。

通過系統(tǒng)分析堆肥過程中微生物變化，發(fā)現(xiàn)土霉素污染下抑制了變形菌門的生長，厚壁菌門則表現(xiàn)出較強(qiáng)耐受性，更具有競爭優(yōu)勢(shì)。孔維棟[27]通過DGGE研究土培條件下土霉素對(duì)于土壤微生物的影響中發(fā)現(xiàn)，在土霉素組中微生物類群主要為變形菌門、放線菌門以及厚壁菌門等。整個(gè)堆肥過程CK組中變形菌門豐度相對(duì)變化不大，而土霉素處理組中厚壁菌門的競爭優(yōu)勢(shì)隨堆肥進(jìn)行而增強(qiáng)，到堆肥后期變?yōu)榈谝粌?yōu)勢(shì)菌群，說明厚壁菌門可能對(duì)土霉素更具有耐受性。

本研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、肉食桿菌屬(Carnobacterium)及假黃色單胞菌屬等在高土霉素脅迫下表現(xiàn)出較高豐度，而在空白組中這些微生物豐度較低，這可能是由于這些微生物能夠利用土霉素等進(jìn)行自身的增殖。徐蓮[20]和王志強(qiáng)[21]分別富集培養(yǎng)到可降解土霉素的菌株，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬。在以不同土霉素底物濃度探究芽孢桿菌屬對(duì)土霉素降解能力中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬最高可降解200 mg·L-1土霉素[21]。在堆肥過程實(shí)際應(yīng)用中，同樣有研究證明，添加芽孢桿菌生物復(fù)合劑可以促進(jìn)堆肥過程中四環(huán)素類抗生素的降解[28]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。而且，我們發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對(duì)土霉素的降解作用要高于溫度，同樣證明了土霉素的生物降解在堆肥過程中起到了重要的作用。Selvam等[16]在利用DGGE研究堆肥對(duì)不同獸用抗生素的降解中同樣在高溫期檢測到芽孢桿菌屬和假黃色單胞菌屬等，其中假黃色單胞菌屬在高溫期DGGE條帶顏色變淺，而本研究中其相對(duì)豐度升高。這可能是由于整個(gè)堆肥過程中土霉素抑制了某些優(yōu)勢(shì)菌的生長，而假黃色單胞菌屬在總OTUs下降的環(huán)境下，其相對(duì)豐度上升。于浩[29]同樣通過微生物富集培養(yǎng)的方法，在畜禽糞便污染的土壤中分離得到土霉素降解菌類芽孢桿菌屬，在本研究中高溫期同樣檢測到高相對(duì)豐度的類芽孢桿菌屬(4.25%)，而在添加土霉素的正常堆肥中，其相對(duì)豐度僅為0.03%。Thermobacillus屬嗜熱菌，在本研究中主要存在于高溫期。王桂珍[30]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬和Thermobacillus對(duì)降解土霉素具有促進(jìn)作用。成潔等[22]同樣發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和無色菌屬(Achromobacter)可以降解土霉素，在本研究中無色菌屬在高土霉素條件下，其相對(duì)豐度較低，在空白與處理實(shí)驗(yàn)中均低于0.2%，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)堆肥處于高溫期，說明高溫不利于無色菌屬的生長。在土霉素污染脅迫下變形菌門整體豐度下降而假黃色單胞菌屬、水微菌屬和Chelatococcus卻呈現(xiàn)豐度的短暫上升，可能是潛在的土霉素降解菌。Xu等[31]和Sugawara等[32]均發(fā)現(xiàn)水微菌屬可以有效地降解多氯聯(lián)苯等污染物，同樣有研究發(fā)現(xiàn)假黃色單胞菌屬中Pseudoxanthomonasspadix BD-a59[33]、Pseudoxanthomonassp.DMVP2[34]、Pseudoxanthomonassp.R-28[35]分別可以降解苯系物、菲等污染物以及纖維素等農(nóng)業(yè)廢棄物，而Chelatococcus尚沒有報(bào)道與抗生素或污染物降解有關(guān)。盡管如此假黃色單胞菌屬、水微菌屬和Chelatococcus是否能夠降解土霉素仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

(1)堆肥可以有效的降解畜禽糞便中的土霉素，微生物驅(qū)動(dòng)的土霉素生物降解是堆肥過程中土霉素降解一個(gè)關(guān)鍵因素。

(2)在土霉素脅迫下，堆肥過程中所含總體OTUs數(shù)目下降，變形菌門相對(duì)豐度下降，而厚壁菌門相對(duì)豐度上升。Bacillus和Paenibacillus可以作為土霉素降解菌在堆肥過程中對(duì)土霉素的降解起到作用，假黃色單胞菌屬、水微菌屬和Chelatococcus可能是潛在的土霉素降解菌，但仍需進(jìn)一步研究。

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