甘南藏族自治州牦牛巴氏桿菌病的細菌分離鑒定及藥物篩選研究

豆思遠,豆 玲,*,盧旺銀，徐崢嶸，李勇生

(1甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046;2甘肅省家畜繁育中心)

牦牛巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一類多種動物共患的一種急性、熱性傳染病,急性病例以敗血癥和出血性炎癥為主要特征。本病病原為多種條件性致病菌，一般認為常存在于健康牛的上呼吸道和消化道粘膜上，正常情況下不引起發(fā)病，當家畜在外界誘因諸如天氣驟變、長途運輸、衛(wèi)生條件差、營養(yǎng)缺乏、飼料突變等不良應(yīng)激因素作用下，機體抵抗力降低時，病菌即可侵入體內(nèi)，大量繁殖，經(jīng)淋巴進入血液，發(fā)生內(nèi)源性感染而發(fā)病。此外，也可經(jīng)呼吸道、消化道以及損傷的皮膚和粘膜感染。

甘南州牦牛生活在地域復(fù)雜、氣候惡劣的高寒缺氧地區(qū)。牦牛巴氏桿菌病在50～60年代曾廣泛流行，造成巨大的經(jīng)濟損失。至80年代由于用牛出敗弱毒菌苗預(yù)防注射，本病得到有效控制。但近年來在甘南州開始陸續(xù)發(fā)生，為進一步分析甘南牦牛巴氏桿菌病發(fā)病情況并篩選出防治甘南牦牛巴氏桿菌病的最佳藥物和治療方案，確保在最短的時間內(nèi)、以最快的速度對發(fā)病牦牛進行治療，實現(xiàn)提高防治效果、降低死亡率的目標，筆者進行了研究。

1 細菌分離鑒定與藥敏試驗

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 由甘南州及所屬轄區(qū)縣區(qū)的各級動物疫控中心，無菌采集2010～2016年間病死牦牛的淋巴結(jié)、肝、肺、脾等病料，并及時送到實驗室置冰箱待檢。共采集病料共計64份。

1.1.2 試劑耗材 培養(yǎng)基基礎(chǔ)及生化鑒定管均購自上?？畦b生物科技有限公司；藥敏紙片購于上海伊華科技有限公司；各類染色用染料均由甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心實驗室制備；其他試劑耗材均由甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱、厭氧培養(yǎng)箱、生物安全柜、不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器、常規(guī)顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 動物接種試驗 無菌環(huán)境下取病料，將其研磨成糊狀，用滅菌生理鹽水(1∶10)稀釋成乳劑，腹腔注射實驗動物8只健康小白鼠，劑量為0.5 mL/只。8只小白鼠均于接種后18～24 h之間死亡，無菌采取心血以及肝病料以便做涂片鏡檢和分離培養(yǎng)。在病料采取完畢后，還對病死小白鼠尸體進行剖檢并觀察病理變化。

1.2.2 涂片鏡檢 用致死小白鼠的心血涂片、肝病料觸片，染色、鏡檢。

美蘭染色：肝組織觸片，共8份。

瑞氏染色：心血涂片，共8份。

革蘭氏染色：共16份。

1.2.3 分離培養(yǎng) 將病料分別無菌接種在5%犢牛血清營養(yǎng)肉湯、血液瓊脂平板和普通瓊脂平板，進行需氧和厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.4 生化試驗 無菌將純培養(yǎng)待檢菌分別接種于各種糖培養(yǎng)基、鄧亨氏蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽、尿素等生化培養(yǎng)基(均由甘南州疫控中心實驗室自制)，37℃，培養(yǎng)8～24 h。

1.2.5 實驗室檢驗結(jié)果綜合判定及藥敏試驗 采用藥敏紙片擴散法，抗菌素種類有OTC(土霉素)、AKN(丁胺卡那)、CFX(頭孢呋新)、AMP(氨芐青霉素)、TET(四環(huán)素)、STR(鏈霉素)、SMM(磺胺甲氧嘧啶鈉)CAR(羧芐青霉素)、KAN(卡那霉素)、CMP(氯霉素)、OXA(苯唑青霉素)、GEN(慶大霉素)等。將純化好的細菌用滅菌生理鹽水與麥氏比濁管比濁，選取1.2×109個活菌/mL濃度的菌懸液，用涂布器均勻涂布鮮血瓊脂平板，每塊平板貼3片，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果并測量抑菌圈(cm)。

1.3 結(jié)果

1.3.1 病理剖檢 在接種局部可見肌肉及皮下組織發(fā)生水腫和發(fā)炎灶；胸腔和心包有漿液性纖維素性滲出物；心外膜有較多出血點；淋巴結(jié)水腫增大；肝臟淤血。

1.3.2 染色鏡檢 將染色好的載玻片置于顯微鏡油鏡下觀察(用100×倍的物鏡10×倍目鏡)，美蘭和革蘭氏染色的涂片在視野中呈卵圓形或球桿菌，兩極濃染。血液涂片用瑞氏染色時，細菌被染成藍色，有少數(shù)呈淡青色。檢查結(jié)果為革蘭氏陰性球桿菌。

1.3.3 分離培養(yǎng) 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性血清肉湯培養(yǎng)24 h后輕度渾濁，連續(xù)培養(yǎng)4～6 d有菌膜產(chǎn)生，液體清澈，管底有粘稠液體；普通瓊脂平板上生長貧瘠；血液瓊脂平板上形成灰白色、圓形、微隆起、半透明、濕潤、表面光滑。邊緣整齊的露滴樣小菌落，不溶血。

1.3.4 生化試驗 生化試驗結(jié)果見表1。

表1 生化試驗結(jié)果

注:“+”陽性,“-”陰性。

表2 巴氏桿菌抑菌圈直徑測量結(jié)果

1.3.5 綜合判定結(jié)果 無菌采集病死牦牛病料經(jīng)涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗、動物試驗等結(jié)果均符合巴氏桿菌的特征，判定為分離出巴氏桿菌，綜合判定為牦牛巴氏桿菌病。

1.3.6 藥敏試驗 藥敏試驗結(jié)果表明，巴氏桿菌對OTC、AKN、SMM、CFX、AMP敏感；對GEN、STR、KAN、CMP中敏；對AMP、TET、OXA不敏感，結(jié)果見表2。

2 藥物治療篩選

為了確實有效地控制牦牛巴氏桿菌病的發(fā)生，最大限度減少農(nóng)牧民的經(jīng)濟損失，采取對發(fā)病牦牛及時治療，根據(jù)藥敏實驗結(jié)果，篩選出有效治療藥物和方案，進行了藥物治療篩選試驗。

2.1 材料與方法

2.1.1 根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查情況 在牦牛巴氏桿菌病流行較為嚴重的地區(qū)作試點，分別在瑪曲縣的阿萬倉鄉(xiāng)、碌曲縣郎木寺鄉(xiāng)、卓尼縣完冒鄉(xiāng)、夏河縣阿去乎鄉(xiāng)、合作市佐蓋多瑪?shù)?個純牧業(yè)鄉(xiāng)各選擇養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖條件相當?shù)酿B(yǎng)殖戶60戶,將這60戶5 842頭牦牛在春季高發(fā)季節(jié)發(fā)病的298頭牦牛分成4組，其中藥物試驗3組,對照1組。試驗組及對照組患病牦牛按年齡、病情嚴重程度均勻分組，其飼養(yǎng)條件基本相同。

2.1.2 藥物試驗組分類 所用藥物分別是第一組土霉素注射液、第二組復(fù)方磺胺甲氧嘧啶鈉、第三組氨芐西林鈉肌注，第四組對照組配合對癥治療,主要使用抗菌消炎藥物。四個組患病牦牛在相同的飼養(yǎng)條件下，輕癥病牦牛開始只用抗菌藥物,部分癥狀加重病畜按重病治療方法治療,以抗菌消炎藥物為主。

2.1.3 試驗由技術(shù)人員具體實施 詳細記錄治療病歷，試驗牦牛是否發(fā)病，以出現(xiàn)牦牛巴氏桿菌病典型的臨床癥狀為依據(jù)，體溫恢復(fù)正常，精神和食欲明顯好轉(zhuǎn)，呼吸困難和各部位水腫癥狀減退，行走自如，能隨群放牧，即判定為治愈。

2.2 結(jié)果

土霉素注射液、復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉、氨芐西林鈉對牦牛巴氏桿菌病均有較好的治療作用。氨芐西林鈉對照組的藥物療效最好，治愈率達90.80%，比對照組自愈率為26.03%的效果明顯，但在實際應(yīng)用中易產(chǎn)生耐藥性，對頭孢類藥物產(chǎn)生耐藥性的可選用土霉素治療。結(jié)果見表3。

表3 三種藥物對牦牛巴氏桿菌病療效比較

3 綜合防控建議

3.1 加強劃區(qū)輪牧管理

及時開展劃區(qū)輪牧，結(jié)合牧民的放牧生活方便性和疫病防控的需要，將放牧牦牛群劃分為“兩大四小”牧場輪牧。兩個大區(qū)(即夏秋、春冬牧場)，四個小區(qū)(在兩個大區(qū)中按每年春、夏、秋、冬四季劃分)，充分利用高原紫外線殺菌、牦牛排泄物發(fā)酵殺菌等自然途徑防止本病感染發(fā)生。夏秋季節(jié)還應(yīng)注意避開過渡陰濕草場放牧。

3.2 消毒滅源及無害化處理

及時開展圈灘場地消毒工作，由于放牧牦牛群休息場地多為圈灘草地，且用繩索相互串聯(lián)，做好圈灘場地消毒工作十分重要，消毒可選用2%燒堿、10%石灰水等有效消毒藥消毒。同時對病死牦牛尸體按照“無害化處理病死牛排泄物、乳、乳制品等按照GB16548-1996《畜禽病害肉尸及其產(chǎn)品無害化處理規(guī)程》”進行無害化處理。

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