分子光譜分析原理在實(shí)踐教學(xué)中的應(yīng)用

鄒文生，王亞琴，邵 群，趙東林，陳少華，馮紹杰

熒光分析法在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)和化學(xué)研究中的應(yīng)用與日俱增，其原因在于熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、非侵入性和使用簡便等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代分析與檢測中發(fā)揮著日益重要的作用[1-3]。對于一個未來合格的科研工作者，了解熒光分析原理及應(yīng)用顯得十分必要。那么，如何在實(shí)際教學(xué)工作中向受教育者傳授分子光譜分析原理，以什么樣的傳授方式最利于受教育者盡快地記住與掌握分子光譜知識是教學(xué)上應(yīng)該解決的問題。牢記原理是關(guān)鍵，課前、課中與課后結(jié)合是手段，與實(shí)踐相結(jié)合是法寶。

圖1 光致發(fā)光過程的Jablonski能級圖(左)與芘的激發(fā)與發(fā)射光譜(右)。字母S(Singlet State)與T(Triplet State)：分別為單重態(tài)與三重態(tài)的第一個字母。F(Fluorescence)與P(Phosphorescence)分別為熒光與磷光的第一個字母。S的下標(biāo)0、1與2分別表示基態(tài)、第一激發(fā)單重態(tài)與第二激發(fā)單重態(tài)。Q(Quench)：猝滅。VR(Vibration Relaxation)：振動弛豫；IC(Inner Conversion)：內(nèi)轉(zhuǎn)換；ISC(Intersystem Conversion)：系間跨越。

1 熒光分析的基本概念與特征

1.1 光致發(fā)光過程的Jablonski能級圖

光的發(fā)射過程與能量變遷緊密相連。圖1-左是光致發(fā)光過程中光電子躍遷的能級變化。當(dāng)沒有外加能量時，分子中電子處在最穩(wěn)定的狀態(tài)—基態(tài)(S0)。當(dāng)分子受光輻照后，外層光電子接收能量向高能級如S1或S2躍遷。處在激發(fā)態(tài)的電子不穩(wěn)定，只能持續(xù)10-8秒量級的時間，然后返回基態(tài)。這時釋放能量有三種方式：1)以光的形式釋放，也就是熒光(F)；2)把能量傳遞給周邊的分子，以釋放熱的形式返回基態(tài)；3)經(jīng)過ISC到激發(fā)三重態(tài)如T1，再以光的形式釋放，這就是磷光(P)，這個過程牽涉到電子的自旋狀態(tài)的2次翻轉(zhuǎn)，能持續(xù)微秒以上，甚至數(shù)十小時的時間。

1.2 熒光的激發(fā)及發(fā)射光譜(見圖1-右)

激發(fā)光譜：不同激發(fā)波長得到固定發(fā)射波長的強(qiáng)度光譜；

發(fā)射光譜：同一激發(fā)波長得到不同發(fā)射波長的強(qiáng)度光譜。

1.3 熒光光譜基本特征(見圖1-右)

1.3.1 Stokes位移

最大激發(fā)與發(fā)射間的波長差。電子的IC、VR等過程均會損失能量，造成發(fā)射光譜紅移。這就如同從高空拋籃球，籃球的彈起高度總低于原始高度，因?yàn)榭諝饽Σ僚c及與地面碰撞都會導(dǎo)致能量損失。如果激發(fā)與發(fā)射過程中能量損失的越小，那么Stokes位移值就越小；反之則越大。如果Stokes位移值越大的話，激發(fā)光對發(fā)射光的干擾越小，越有利于熒光在生物造影方面的應(yīng)用。

1.3.2 激發(fā)與發(fā)射光譜呈鏡像對稱關(guān)系

理論上，如果沒有能量損失的話，激發(fā)與發(fā)射光譜光譜呈現(xiàn)鏡像對稱關(guān)系。但由于能量損失總是不免發(fā)生與及熒光團(tuán)所處化學(xué)微環(huán)境差異，導(dǎo)致光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)的消失而出現(xiàn)一定的偏差。芘是用于測量溶液極性的熒光探針，嚴(yán)格來講，它的激發(fā)與發(fā)射光譜呈現(xiàn)指狀峰特征，但由于化學(xué)微環(huán)境的差異，激發(fā)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)消失的更多，但尚能看出粗略的鏡像關(guān)系。

1.3.3 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

在實(shí)踐中就可以知道，用藍(lán)于或紅于最大激發(fā)波長的光去掃描發(fā)射波長，得到的光譜輪廓是一樣的，只是強(qiáng)度上存在差異。同樣的，激發(fā)光譜的形狀與發(fā)射波長無關(guān)。正如圖1-左所示，激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的輪廓是一致的。

牢記上述的熒光分析的基本概念與特征，正確理解Jablonski能級圖與熒光光譜基本特征，是學(xué)習(xí)與把握分子光譜分析的基礎(chǔ)。

2 熒光分析法的教學(xué)組織與過程管理(見表1)

表1 熒光分析法的教學(xué)組織與過程管理

正確學(xué)習(xí)光譜分析法就必須把課前、課中與課后有機(jī)的結(jié)合起來。學(xué)生做好課前預(yù)習(xí)，做到對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有一個大致的把握，同時，也可以發(fā)現(xiàn)對分子光譜分析理解不透徹的知識點(diǎn)，以備正式上課時提問，認(rèn)真撰寫熒光檢測預(yù)習(xí)報(bào)告，做到腦海中有一個大致的實(shí)驗(yàn)操作雛形；在實(shí)驗(yàn)操作中，首先了解熒光分光光度計(jì)儀器原理及與紫外分光光度法的異同，聽講實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并認(rèn)真瀏覽老師的實(shí)驗(yàn)演習(xí)，適當(dāng)?shù)臄D出時間給學(xué)生提問，讓學(xué)生做到對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的完全把握。然后按預(yù)定小組內(nèi)分工進(jìn)行VB2的熒光檢測實(shí)驗(yàn)，認(rèn)真記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)最好交叉進(jìn)行，讓每個同學(xué)盡量接觸到實(shí)驗(yàn)的每一個步驟，使同學(xué)們對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由理論認(rèn)識升華到感性認(rèn)識。課中，抽時間檢查學(xué)生預(yù)習(xí)報(bào)告，發(fā)現(xiàn)報(bào)告中存在的共同問題，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在課堂中細(xì)心講解。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，講解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)方法，課后完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告撰寫與課后練習(xí)題。整理實(shí)驗(yàn)器材，做到干凈整潔，盡量維持與實(shí)驗(yàn)前一個樣。批閱實(shí)驗(yàn)報(bào)告，根據(jù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)確性與認(rèn)真程度給予恰當(dāng)?shù)脑u定，對仍舊存在的問題，在網(wǎng)絡(luò)平臺及時與學(xué)生交流。

3 在科研過程中理解與升華分子光譜分析法

在科研中學(xué)習(xí)與鞏固熒光分析法的基本內(nèi)容，做到理論與實(shí)踐結(jié)合。熒光分析法中熒光是一種檢測信號，與其它的檢測電、磁、質(zhì)量與場等信號是一樣的道理。只要被檢測物的介入會導(dǎo)致熒光信號的衰減、增強(qiáng)與平移等，就能夠?qū)崿F(xiàn)被檢測物的高靈敏檢測；如果共存基質(zhì)對被監(jiān)測物的干擾小甚至沒有，就能夠?qū)崿F(xiàn)對被檢測物的選擇性檢測；在有干擾存在時，想辦法掩蔽干擾物質(zhì)以實(shí)現(xiàn)無繁冗預(yù)處理檢測。

下面以近段時間以來本課題組導(dǎo)師制下學(xué)生參與的所發(fā)表的工作為例來闡述對熒光分析法的理解與深化。我們合成了一個檸檬酸與聚乙烯亞胺共碳化點(diǎn)[4]，并研究了它的光物理化學(xué)性能及傳感潛力。圖2-A是碳點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化激發(fā)與發(fā)射光譜，這兩個光譜的對稱關(guān)系較好，契合了分子光譜的鏡像特征原理。擁有比傳統(tǒng)染料更寬的Stokes位移，可有效減少散射光和激發(fā)光對發(fā)射光譜的影響，適合生物成像。插圖顯示此碳點(diǎn)有很高的熒光量子產(chǎn)率(～54%，硫酸喹啉作標(biāo)準(zhǔn))。在生態(tài)pH值(7.4)下，該碳點(diǎn)在Zn2+存在下通過抑制光誘導(dǎo)電子路徑增強(qiáng)熒光，在Cu2+或Co2+存在下通過內(nèi)濾效應(yīng)猝滅熒光，這意味著此碳點(diǎn)可以做光傳感器探測環(huán)境中的上述三種離子(圖2-B,C)。插圖顯示了不同離子存在下的碳點(diǎn)熒光成像，圖片亮度差異明顯，暗示了碳點(diǎn)對這些離子探測的高靈敏度。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)離子對碳點(diǎn)作用的優(yōu)先順序：碳點(diǎn)對Cu2+或Co2+具有更強(qiáng)的絡(luò)合能力。也就是說，當(dāng)碳點(diǎn)被Zn2+增強(qiáng)后可以用作增強(qiáng)的光響應(yīng)Cu2+或Co2+探針，這有利于探測靈敏度的提高。圖2-D是將此探針應(yīng)用于環(huán)境中實(shí)際水樣品中Co2+檢測。該碳點(diǎn)在0.012-12 μM內(nèi)顯示了一個寬的線性響應(yīng)范圍，線性回歸方程為Y = 0.0423C + 0.04207(Y = log(F0/F)，F(xiàn)0、F與C分別為原始熒光強(qiáng)度、即時熒光強(qiáng)度與離子濃度)，R = 0.999，探測限為8.0nM，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.7% (n = 5)。碳點(diǎn)展示了可忽略的細(xì)胞毒性、優(yōu)秀的生物相容性與高光穩(wěn)定性，并應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)離子的共聚焦成像與半定量檢測。這些應(yīng)用鞏固了熒光分析法應(yīng)用中的VB2檢測內(nèi)容，深化了熒光分析法的應(yīng)用范圍。

圖2 檸檬酸與聚乙烯亞胺共碳化點(diǎn)的光物理化學(xué)性能(上)。碳點(diǎn)激發(fā)與發(fā)射光譜(A)，插圖為碳點(diǎn)在365nm紫外燈照射下的熒光成像。Zn2+光響應(yīng)增強(qiáng)碳點(diǎn)對Co2+的熒光滴定光譜(B)，插圖1、2和3分別為碳點(diǎn)、Zn2+光響應(yīng)增強(qiáng)碳點(diǎn)與加入Co2+后的熒光成像。常見離子對碳點(diǎn)的熒光響應(yīng)(C)。Co2+滴定碳點(diǎn)的熒光光譜圖(D)，插圖為檢測水中Co2+的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。碳點(diǎn)對Zn2+與Co2+熒光響應(yīng)示意圖與相應(yīng)的Hela細(xì)胞成像應(yīng)用(下)。

圖3 間-溴苯酚殺蟲劑基碳點(diǎn)制備并應(yīng)用于圖片打印與細(xì)胞成像(1)。Pb2+誘導(dǎo)的5-碘水楊酸晶狀納米粒子的無保護(hù)室溫磷光(2)。熒光素異氰酸酯修飾的聚乙烯亞胺TNT熒光傳感探針(3)。磁性熒光的TNT雙識別探針(4)。

另外，我們也發(fā)展了其它的發(fā)光納米材料并進(jìn)行了廣泛應(yīng)用[5-8](圖3)，進(jìn)一步的加深對熒光分析法的理解，做到對熒光分析法的應(yīng)用自如。比如，我們以殺蟲劑間-溴苯酚為碳源制備了高亮碳點(diǎn)，并將其用作無色墨水打印圖案(如安徽建筑大學(xué)徽派校門)與細(xì)胞成像。最可喜的是經(jīng)過碳化以后，殺蟲劑的毒性幾乎沒有了[5](圖3-1)。另外，Pb2+誘導(dǎo)的5-碘水楊酸醇溶夜產(chǎn)生晶狀納米粒子，這種結(jié)構(gòu)致密的粒子保護(hù)了5-碘水楊酸的激發(fā)三重態(tài)，從而觀察到5-碘水楊酸的無保護(hù)室溫磷光(圖3-2)。我們也發(fā)展了熒光素異氰酸酯修飾的聚乙烯亞胺(圖3-3)與Fe3O4磁性納米粒子(圖3-4)，構(gòu)建了熒光猝滅與散射增強(qiáng)的TNT雙識別探針。通過參與上述的科研活動，使學(xué)生熟練的掌握了熒光分析法原理，并拓寬了熒光分析法應(yīng)用視野，為獨(dú)立開展熒光分析方面的工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 總結(jié)

熒光分析是樣品檢測中常用的重要的方法之一。本文主要講述了熒光分析的基本概念與特征，強(qiáng)調(diào)了學(xué)習(xí)過程中的課前、課中與課后結(jié)合的重要性，并用科研成果鞏固熒光分析法的基本內(nèi)容，顯示熒光分析了熒光分析法在樣品檢測與分子識別領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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