高效液相熒光法測定豬肉中抗氧化劑乙氧基喹啉以及代謝產(chǎn)物二聚乙氧基喹啉

舒曉夢，趙素娟，王羚佳，郭登峰，陳祥貴，楊瀟，羅靜

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

乙氧基喹啉又稱乙氧喹啉、山道喹、虎皮靈、防老劑AW、抗氧喹、乙氧喹，化學名稱：6-乙氧基-1，2-二氫化-2，2，4-三甲基喹啉(6-ethoxy-1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinoline，EQ)。英文名：ethoxyquin，相對分子質(zhì)量：217.31。它具有較強的防霉和保鮮作用，可防止脂肪、蛋白質(zhì)飼料在貯存過程中變質(zhì)，常被用于蘋果、梨等水果的保鮮；另外，它具有較強的抗氧化作用，是目前動物飼料中應用廣泛、效果好而又經(jīng)濟的抗氧化添加劑[1-3]。

二聚乙氧基喹啉，化學名稱：8-(6-乙氧基-2,2,4-三甲基-1,2-二氫-1-喹啉基)-6-乙氧基-2,2,4三甲基-1,2-二氫喹啉，英文名：ethoxyquin dimer(EQDM)，相對分子質(zhì)量：432.59，該品為乙氧基喹啉在生物體內(nèi)的主要代謝物[4-6]，其在生物體中的含量與喂入生物體乙氧基喹啉的量有關[7]，且有較好的穩(wěn)定性[5]。

由于對EQ的毒理性質(zhì)已有清楚的了解，目前國內(nèi)外對食品中EQ的限量值已有明確的規(guī)定[8-9]，也建立了針對EQ的檢測方法[10-14]。但是EQ的主要代謝產(chǎn)物EQDM的潛在毒性目前尚不清楚，有研究對EQDM第一階段和第二階段生物轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)錄反應進行了模擬，發(fā)現(xiàn)在相同的酶系統(tǒng)上，EQDM的生物轉(zhuǎn)化與母體化合物(EQ)的生物轉(zhuǎn)化相當，能激活相同的酶體系[15-17]。由于EQDM的穩(wěn)定性比EQ更好[5]，可能產(chǎn)生更高的殘留量，因而可能存在安全風險。但目前的研究中對于EQDM的檢測方法卻鮮有報道。

在本研究中通過優(yōu)化樣品前處理方法和液相分析檢測條件建立了同時檢測豬肉中EQ及其代謝產(chǎn)物EQDM的高效液相熒光法。經(jīng)方法學評價，該方法具有較好的精密度和準確性。本研究的結(jié)果可以為EQDM的代謝過程、毒理學性質(zhì)研究，以及EQ和EQDM在豬肉中殘留量的監(jiān)測提供有效的分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉，市售；正己烷、丙酮、乙酸(色譜純)、乙腈(色譜純)，購自美國Tedia公司；EQ標準品(純度>98%)，EQDM標準品(純度>98%)，購自上海甄準生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LC20高效液相色譜儀(帶熒光檢測器)，日本島津公司；RF6000熒光分光光度計，日本島津公司；TB-214電子天平型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；MS3組織勻漿機，德國IKA公司；BZF-50真空干燥箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；微型攪拌器、超聲波清洗儀，中國玉環(huán)曙峰企業(yè)。

1.3 樣品的前處理方法

稱取一定量的樣品，用濾紙吸干表面水分，組織勻漿機勻漿后稱取5.000 g的樣品，于50 mL具塞離心管中，加入15 mL正己烷，30 ℃超聲提取10 min，4 ℃ 5 000 r/mim離心10 min，提取10 mL上清液30 ℃真空干燥至近干，再加入1 mL乙腈溶解，并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，待測。

1.4 HPLC分析測試條件

色譜柱: Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長：360 nm，吸收波長：440 nm；流動相：V(乙腈)∶V(2%乙酸)=85∶15，柱溫為30 ℃；流速1 mL/min；進樣量:20 μL。

1.5 樣品中EQ和EQDM含量的定量分析

以EQ和EQDM的保留時間(RTEQ：5.86 min、RTEQDM：32.44 min)定性。以外標法定量，分別以各標準溶液峰面積及對應質(zhì)量建立標準曲線及回歸方程，再根據(jù)樣品中EQ和EQDM的峰面積，按下式計算樣品中EQ和EQDM的含量：

(1)

(2)

式中：CEQ,樣品中EQ的含量，μg/g；CEQDM,樣品中EQDM的含量，μg/g；MEQ,20 μL樣品液中EQ的含量，μg；MEQDM,20 μL樣品液中EQDM的含量，μg；20,樣品進樣體積20 μL；1 000,樣品提取液揮干后定容至1 000 μL；15,提取液體積，mL；10,移取10 mL提取液上清進行真空干燥，mL；MS,取樣量，g。

1.6 EQ、EQDM檢測方法的條件優(yōu)化與評價

1.6.1 色譜分離檢測條件的優(yōu)化

根據(jù)EQ、EQDM標準品的熒光光譜選擇適合的激發(fā)和發(fā)射波長，并在該條件下比較不同比例流動相、流速和柱溫的對EQ、EQDM的分離效果，從而篩選出適合的色譜分離條件。

1.6.2 EQ、EQDM的前處理優(yōu)化

為優(yōu)化樣品破碎方法，對樣品分別采用勻漿機破碎和液氮研磨兩種破碎方法進行處理。為優(yōu)化提取溶劑種類，分別采用丙酮、乙腈、正己烷對EQ、EQDM進行提取。通過比較提取液中EQ、EQDM的加標回收率和RSD值，從而選擇適合的樣品破碎方法和提取溶劑。

1.6.3 方法學評價

為評價該方法的重現(xiàn)性，取5份加標平行樣品，根據(jù)樣品處理和檢測條件測定EQ、EQDM的含量，分別計算其RSD值。為評價方法的穩(wěn)定性，將5份加標樣品按上述樣品提取后分別放置0、3、6、9、12 h后檢測，分別計算其RSD值，考察其穩(wěn)定性。為評價方法的準確度，在樣品中分別加入0.012、0.036、0.060 μg EQ和0.045、0.075、0.096 μg EQDM標準品，按本研究所確定的樣品前處理方法和檢測條件，對每個加標濃度樣品進行5次平行試驗，計算其加標回收率和RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 EQ、EQDM最適檢測條件優(yōu)化

在已有研究的基礎上確定EQ、EQDM的最適的激發(fā)和發(fā)射波長[18-19]，設置激發(fā)波長為360 nm時，在發(fā)射波長400～500 nm檢測，發(fā)現(xiàn)EQ和EQDM在440 nm處均有最大的熒光強度；設置發(fā)射波長為440 nm時，在激發(fā)波長250～500 nm，檢測發(fā)現(xiàn)EQ和EQDM在360 nm處有較大的熒光強度(如圖1)。因此，將熒光檢測器的檢測條件設置為：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。

2.2 色譜分離檢測條件優(yōu)化

通過比較不同比例流動相、柱溫的分離效果，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)流動相：V(乙腈)∶V(2%乙酸)=85∶15、柱溫：30 ℃、流速：1 mL/min時，目標化合物的柱效(大于2 000)和分離度(大于2.5)較高，同時EQ的保留時間:5.86 min，EQDM的保留時間:32.44 min，對樣品的分析時間在35 min完成、基線平穩(wěn)、噪音小、峰形尖銳對稱并無拖尾現(xiàn)象,如圖2所示。

2.3 方法的線性范圍和定量限

用流動相V(乙腈)∶V(2%乙酸)=85∶15配制濃度為8×10-3μg/mL的EQ標準溶液，分別進樣20、40、60、80、100 μL，對應EQ質(zhì)量為：16×10-5、32×10-5、48×10-5、64×10-5、80×10-5μg；配制質(zhì)量濃度為0.01 μg /mL的EQDM標準溶液，分別進樣60、80、100、120、140 μL，對應EQDM質(zhì)量為：0.6×10-3、0.8×10-3、1.0×10-3、1.2×10-3、1.4×10-3μg。按照1.4中的色譜條件進行分析，以標準品質(zhì)量(μg)為橫坐標，以峰面積為縱坐標作圖，建立線性回歸方程。所得EQ回歸方程為：Y=604.27X-8 446,R2=0.998 6；EQDM回歸方程為：Y=1 425.3X-6 140.8,R2=0.997 6。結(jié)果表明：EQ在16×10-5～80×10-5μg內(nèi)，EQDM在0.6×10-3～1.4×10-3μg內(nèi)，線性關系良好，相關系數(shù)均高于0.99。以10倍信噪比(S/N)計算定量限，根據(jù)計算公式該方法的定量限(LOQ)EQ為0.002 4 μg/g，EQDM為0.009 μg/g。

a-激發(fā)波長為360 nm時，EQ的發(fā)射光譜； b-發(fā)射波長為440 nm時，EQ的激發(fā)光譜； c-激發(fā)波長為360 nm時，EQDM的發(fā)射光譜； d-發(fā)射波長為440 nm時，EQDM的激發(fā)光譜。圖1 EQ和EQDM的熒光光譜Fig.1 The fluorescence spectra of EQ and EQDM

a-EQ和EQDM混合標品色譜圖;b-加標樣品色譜圖圖2 色譜分離檢測條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of chromatography separation and detection conditions

2.4 前處理條件優(yōu)化

不同的破碎方法下,樣品中EQ、EQDM提取效果有一定的差異。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)采用勻漿機破碎時能很好的破碎肌肉組織，EQ、EQDM的回收率相對較高且RSD值較小(見表1)。而采用液氮研磨時，樣品容易結(jié)冰，不能很好的破碎組織 。這可能是由于目標化合物的含量較小,需要較大的樣品取樣量，且肌肉組織中含有較多的水分易結(jié)冰，反而不利于組織充分破碎。因此選用組織勻漿機進行樣品破碎。

表1 不同破碎方法下EQ、EQDM平均回收率和RSD值Table 1 The average recovery rate and RSD of EQ andEQDM were compared with different crushing methods

由于EQ和EQDM屬于弱極性化合物,不溶于水，易溶于有機溶劑[20-22]，分別采用乙腈、正己烷、丙酮進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率：正己烷>丙酮>乙腈(見表2)，且RSD值小于5%，雜峰和基線噪音均較小。故選擇正己烷作為提取溶劑。

表2 不同提取方法下EQ、EQDM平均回收率和RSD值Table 2 The average recovery rate of EQ and EQDM andRSD value were obtained by different extraction methods

2.5 方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

取同加標樣品提取液共5份，分別進樣后，根據(jù)EQ、EQDM的峰面積計算的RSD值分別為2.44%、3.55%，RSD值均小于5%，表明該方法的重現(xiàn)性良好；同時將5份加標樣品分別放置0、3、6、9、12 h后，分別測定EQ、EQDM峰面積的RSD值為3.61%、4.06%，RSD值均小于5%，由此表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.6 方法的加標回收率、精密度和檢出限

在加標回收率實驗中，通過來自加標的豬肉樣品的分析物回收率來評估該檢測方法的準確性。在5.000 g樣品中按照低、中、高3個濃度加入EQ和EQDM標準溶液，即：分別加入0.012、0.036、0.060 μg EQ標準液以及0.045、0.075、0.096 μg EQDM標準液進行加標回收實驗，按本研究所確定的EQ、EQDM的最佳前處理方法和檢測條件，對每個加標濃度樣品進行3次平行試驗，并計算EQ、EQDM的加標回收率及相對標準偏差(RSD)，結(jié)果(見表3)。該方法對EQ的平均回收率為93.88%～107.18%，EQDM的回收率為80.74%～83.62%，RSD均小于2%。以3倍信噪比(S/N)計算檢出限，根據(jù)計算公式該方法的檢出限(LOD)EQ為0.000 8 μg/g，EQDM為0.003 μg/g。說明該方法的準確性和重現(xiàn)性好，檢出限低，符合殘留分析要求,能夠滿足檢測豬肉樣品中EQ、EQDM含量的要求。

表3 EQ和EQDM回收率和RSD值表Table3 EQ and EQDM Recovery rate and RSD

2.7 樣品檢測

采用此方法對多批次市售豬肉進行抽樣檢測，檢測結(jié)果表明，此次抽取的樣品均未檢出EQ及其代謝產(chǎn)物EQDM。

3 結(jié)論

本實驗建立了采用HPLC—熒光法測定豬肉中乙氧基喹啉以及代謝產(chǎn)物二聚乙氧基喹啉殘留量的方法。該方法具有操作簡單、選擇性好、背景干擾小的特點，對儀器要求不高，重現(xiàn)性和準確度都較好，檢出限和定量限較低，滿足豬肉中EQ、EQDM殘留量檢測的需求。

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