不同檢查方法對乳腺癌侵犯NAC臨床檢出率的影響

董良鵬，張景航

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 河南 新鄉(xiāng) 453100）

近100年來，乳腺癌的臨床手術方式不斷演變與革新。當今，腫瘤完整切除與乳房外形美容效果并重的理念在乳腺癌術式發(fā)展趨勢中愈發(fā)成為主流。其中，乳頭乳暈復合體（nipple-areola complex, NAC）被保留，對重建后好的乳房外形美容效果具有重要影響。作為一種全身性疾病，乳腺癌在發(fā)病早期，可通過血液發(fā)生遠處轉移[1-2]；NAC歸屬于乳腺導管系統，將其保留意味著在一定程度增加殘留癌的風險。行保留NAC乳房切除術（nipple-areola complex sparing mastectomy,NSM）即乳腺癌改良根治術，預知NAC受癌侵犯的概率非常必要。然而關于乳腺癌侵犯NAC的臨床檢出率相關報道有差異，2008～2014年的文獻顯示為8.9%～28.0%，平均16.7%[3-14]。有學者指出，NAC的不同病理標本獲取方式及檢查方法是影響乳腺癌侵犯NAC臨床檢出率的重要因素[12]。本研究采用兩種不同的NAC取材方法，分別經蘇木精-伊紅（hematoxylineosin, HE）染色與免疫組織化學法（簡稱免疫組化）染色（immunohistochemistry, IHC），旨在考察不同檢查方法對乳腺癌侵犯NAC臨床檢出率的影響，繼而為臨床乳腺癌患者接受NSM術治療提供可行性參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月-2016年11月在本院接受乳腺癌根治術治療的原發(fā)性乳腺癌女性患者病理標本240例，采用隨機數字表法分為觀察組與對照組，各120例。其中，觀察組病理標本所屬患者年齡28～48歲，平均（37.4±8.2）歲；參照美國癌癥聯合委員會提出的乳腺癌分期標準，Ⅰ期33例，Ⅱ期87例。對照組病理標本所屬患者年齡27～51歲，平均（38.6±9.4）歲；Ⅰ期39例，Ⅱ期81例。另同期選取已證實為乳腺癌與乳腺腺病患者各20例，將乳腺癌組織與乳腺腺病皮膚組織分別作為本研究IHC檢查的陽性與陰性對照樣本。乳腺癌病理組織標本排除標準：①明確為Paget's??；②合并NAC肉眼可見異常，如凹陷、潰瘍破損、出血溢液、濕疹樣改變、乳頭后方捫及腫塊等；③術前有接受新輔助化療治療；④初治時已發(fā)生有遠處轉移。

1.2 方法

1.2.1 取材 對照組于乳頭的正中矢狀面進行取材，取材深度5 mm；觀察組取乳頭與乳暈皮膚以及連同皮下10 mm的整塊組織，采用本院自創(chuàng)5刀法：于乳頭正中矢狀面切1刀作為首刀，再根據患者乳頭實際大小平行首刀于兩側每隔1～2 mm各切2刀，最后在乳頭根部一分為二。

1.2.2 檢查 分別經常規(guī)HE及IHC處理后鏡檢。IHC處理方法為：選擇細胞角蛋白19（cytokerantin-19,CK-19）為目標蛋白，抗體及相關試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。將取得的組織標本經10%甲醛固定，再經脫水、透明、浸蠟及包埋程序處理后，4 μm連續(xù)切片，采用En Vision 2步法，將切片經烤片、脫蠟，逐級乙醇由高至低至入水，入3%過氧化氫液5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）浸3遍，5 min/遍，放入pH 6.0檸檬酸緩沖液中高溫高壓修復：高壓鍋噴氣后，加熱2 min，改中火2 min，之后關火并持續(xù)燜10 min，結束后放至冷水中冷卻至37℃并進行1 min胃酶消化，放入PBS緩沖液洗3遍，加CK-19一抗（鼠抗人單克隆抗體），4℃冰箱孵育過夜，PBS緩沖液浸3遍，5 min/遍，加二抗PV6000（通用型抗體）37℃ 10 min，PBS緩沖液浸3遍，DAB顯色，蘇木素復染，乙醇由低至高濃度逐級脫水至入二甲苯，封片。完成后由2位經驗豐富的檢驗科診斷醫(yī)師共同評估，所得結果定為最終的病理診斷結果。以鏡檢中觀察到細胞膜細胞漿內有棕黃色顆粒為陽性。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

20例已證實為乳腺癌的乳腺癌組織經IHC處理后檢查結果顯示均為陽性，20例已證實為乳腺腺病的乳腺腺病皮膚組織織經IHC處理后檢查結果顯示均為陰性。將乳腺癌侵犯NAC的檢出情況分別進行組內及組間比較，結果顯示：兩種方法處理后的檢出率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組IHC處理后的檢出率高于HE檢出率；對照組兩種方法處理后的檢出率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；經HE處理后，兩組患者檢出率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；經IHC處理后，觀察組檢出率高于對照組（P＜0.05），見附表和圖1～ 2。

附表 兩組患者乳腺癌侵犯NAC的檢出率比較[n =120，例（%）]

圖1 NAC癌細胞侵犯 （HE ）

圖2 NAC癌細胞微侵犯 （IHC）

3 討論

在理想控制腫瘤病情的基礎上最大程度提升手術美容效果是現代乳腺外科的重要目標之一[15]。傳統乳腺癌乳房切除術通常要求先將NAC切除，乳房重建手術時一并將其重建。相關資料顯示，有36%的乳房重建患者對乳頭重建效果并不滿意，甚至由此誘發(fā)心理問題[16]。FREEMAN[17]1962年首次提出NSM術式和相關理念，但該術式對乳腺癌治療的安全性曾一度引發(fā)爭議。隨著對乳腺癌生物學特性認知的加深及其治療手段的持續(xù)進步，目前多個醫(yī)療機構通過大樣本前瞻性試驗證實NSM在長期生存率方面已愈發(fā)趨近傳統根治術[18]。盡管如此，關于NSM治療當前仍尚有許多問題未達成統一，其中每位患者是否具備有接受NSM治療的指征尤為關鍵，而開展NSM術前病例篩選的基本標準即是要求腫瘤未侵犯NAC[19]。在臨床實際工作中，NSM治療多在Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者中開展，故本研究所收集的240例病例標本其患者均為Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌，具有臨床代表性。

在臨床乳腺癌標本的切除處理過程中，NAC病理取材方法主要涉及取材方向、取材深度以及取材間隔和數量等因素，這些因素選擇不同的標準是導致最終獲得NAC侵犯檢出率呈差異的重要原因。就取材方向來看，主要包括依照矢狀面與冠狀面兩種方法取材，臨床采用矢狀面取材為主，而傳統NAC取材通常于乳頭正中矢狀面取1塊。有學者研究發(fā)現，乳腺癌侵犯NAC并非完全呈中心性特征，因此于乳頭正中矢狀面取材可造成假陰性率嚴重偏高[20]。就取材深度來看，各研究也存在較大差異，從3～20 mm不等。侵犯較輕者若取材過淺也可能導致假陰性率升高；NAC定義為乳頭與乳暈及其下方10 mm之內的乳腺組織，故取材過深，甚至達到RUSBY[4]報道的20 mm，則可能導致假陽性率升高。在其研究中，NAC侵犯率達到24.6%。在本研究納入的對照文獻中處于較高水平，不排除有假陽性樣本的可能。就取材間隔及數量來看，參考復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科所采用的取材方法：垂直于乳腺表面沿矢狀面每隔3～5 mm將NAC多切面切開，再于最大矢狀面選擇性取材1、2塊。在本研究中，筆者考慮到實際臨床操作時，為預防NAC在術后發(fā)生缺血壞死往往于基底多保留5～10 mm，這也比較符合NAC的解剖結構，故本研究在取材時選取乳頭與乳暈皮膚以及連同皮下10 mm的整塊組織更具臨床參考意義。另外采用本院自創(chuàng)5刀法，提示該取材方法通過縮小取材間隔并適當增加樣本獲取量，可實現更全面且多點位掌握NAC受侵犯情況，避免傳統取材造成的漏診或誤診；同時基于取材深度與NAC解剖結構的貼合，其結果也更具客觀性與準確性。

乳腺癌在其早期即可發(fā)生微小轉移，因此在該階段內及時發(fā)現這些微侵犯灶對指導臨床開展乳腺癌治療具有特殊意義。細胞角蛋白（cytokerantin, CK）是一種分布于外胚層起源細胞中的中間纖維絲，為細胞骨架的組分之一。研究認為[21]，在細胞轉化過程中CK所具有的亞微結構及免疫學特性一般不會改變，故檢測其類型有助于判斷腫瘤組織學來源。本研究所選擇的目標蛋白CK-19正常情況下在上皮性腫瘤（如乳腺癌、胃腸癌及肺癌等）組織中穩(wěn)定表達，但在外周血、淋巴結、皮膚以及NAC中不表達[22]。也就是說，在NAC中找到CK-19陽性細胞即可被認定為已經發(fā)生轉移的乳腺腫瘤細胞。自上世紀90年代以來，CK-19即被廣泛應用于包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤微轉移的檢測，并呈高敏感性與特異性。本研究20例已證實為乳腺癌的組織樣本均為陽性，20例已證實為乳腺腺病的組織樣本均為陰性，進一步驗證將CK-19作為目標蛋白的可行性。

綜上所述，本研究采用的乳頭矢狀面5刀法取材是一種更客觀更全面的取材方法。選擇CK-19為目標蛋白并行IHC處理有助于發(fā)現NAC的微侵犯灶，將以上取材方法及檢測方法聯合運用所獲得的乳腺癌侵犯NAC檢出率可更準確地反應乳腺癌NAC受累的真實情況，具有臨床指導意義。

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