解密圓環(huán)疫苗新時(shí)代風(fēng)向標(biāo)一一圓柯欣

周盼伊

豬圓環(huán)病毒（Porcinecircoviruses，PCV）是單股環(huán)狀的DNA病毒，基因組長(zhǎng)度約為1.7kb長(zhǎng)，是最小的動(dòng)物病毒之一。已經(jīng)確定有兩種類型的PCV，即圓環(huán)病毒1型（PCVl）和圓環(huán)病毒2型（PCV2）。

PCV1對(duì)豬只沒有致病性，PCV2于1998年首次報(bào)道，其在臨床條件下能引起豬只的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒orcinecircovirus associated diseases，PCVAD），主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、肺炎、豬皮炎和腎病綜合征和繁殖障礙，主要表現(xiàn)為呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經(jīng)、繁殖系統(tǒng)以及皮膚的功能紊亂，對(duì)全世界的生豬養(yǎng)殖造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

調(diào)查數(shù)據(jù)表明：目前各規(guī)模豬場(chǎng)圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。?PCVAD）的平均經(jīng)濟(jì)損失，最低為34.33元，還不包括圓環(huán)病毒疫病爆發(fā)導(dǎo)致的損失。（數(shù)據(jù)來(lái)源：規(guī)模豬場(chǎng)圓環(huán)病毒相關(guān)病（ PCVAD）經(jīng)濟(jì)損失評(píng)估報(bào)告，第四次豬病學(xué)研討會(huì)會(huì)議論文集）。

協(xié)同感染是PCV2致病性的主要起因，副豬嗜血桿菌、PRRSV和豬支原體肺炎在實(shí)驗(yàn)和田間條件下都會(huì)加劇與PCV2相關(guān)的損傷，增加PCVAD的發(fā)生率。

疫苗在豬圓環(huán)病毒病的防控起到非常重要的作用，2010年，普萊柯上市了國(guó)內(nèi)首個(gè)豬圓環(huán)病毒疫苗。目前，有33家圓環(huán)疫苗生產(chǎn)廠家取得了批準(zhǔn)文號(hào)，10種疫苗類型中，以不同毒株的全病毒圓環(huán)滅活疫苗為主，而基因工程疫苗則是疫苗企業(yè)爭(zhēng)相研發(fā)的風(fēng)向標(biāo)，除了2017年11月隆重上市的“圓柯欣”外，9家企業(yè)正在開發(fā)9種不同的圓環(huán)基因工程苗。

為什么研發(fā)重點(diǎn)由全病毒圓環(huán)滅活疫苗轉(zhuǎn)為基因工程亞單位疫苗了呢？全病毒滅活疫苗，因圓環(huán)病毒培養(yǎng)難度高、不同批次間病毒培養(yǎng)滴度差異明顯、抗原滅活過(guò)程會(huì)損害抗原的免疫原性以及抗原未進(jìn)行純化等原因，一般需進(jìn)行二次免疫才能達(dá)到理想效果且會(huì)存在一定的免疫副反應(yīng)。基因工程亞單位疫苗只包含Cap蛋白，不僅免疫原針對(duì)性強(qiáng)，而且抗原含量高、純度高，免疫劑量和次數(shù)都有減少，因此越來(lái)越受到養(yǎng)殖戶青睞。

國(guó)內(nèi)首個(gè)純病毒樣顆粒豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗（大腸桿菌源）——“圓柯欣”又有怎樣的新特點(diǎn)呢？豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒疫苗是通過(guò)把豬圓環(huán)病毒的主要抗原基因?qū)氲奖磉_(dá)載體中進(jìn)行高效表達(dá)，然后把表達(dá)的免疫原性蛋白（CAP蛋白）組裝成病毒樣顆粒而制成的基因工程亞單位疫苗。與傳統(tǒng)豬圓環(huán)病毒滅活疫苗相比，豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒疫苗具有不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

“圓柯欣”上市發(fā)布會(huì)后，業(yè)內(nèi)國(guó)內(nèi)外多位豬病防控專家對(duì)其進(jìn)行了熱烈討論。

焦點(diǎn)一：病毒樣顆粒應(yīng)用于圓環(huán)疫苗有何優(yōu)勢(shì)？

病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLPs）是由病毒單一或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白質(zhì)顆粒，保持了病毒抗原蛋白的天然構(gòu)象，因而具備激發(fā)宿主先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)功能。在形態(tài)上，VLPs類似未成熟的病毒粒子，但是由于缺乏調(diào)節(jié)蛋白和感染性核酸，無(wú)復(fù)制和感染能力。在過(guò)去的三十年中，病毒樣顆粒技術(shù)應(yīng)用逐漸廣泛，尤其在疫苗領(lǐng)域。

區(qū)別于昆蟲細(xì)胞/}干狀病毒系統(tǒng)的VLPs體內(nèi)組裝，VLPs的體外組裝可以很好的避免細(xì)胞內(nèi)其它蛋白、核酸的干擾，組裝出更均一的VLPs。

病毒樣顆粒具有安全性更高、免疫原性更強(qiáng)、副反應(yīng)更小、操作更方便等諸多優(yōu)勢(shì)。豬圓環(huán)病毒病毒樣顆粒疫苗選用的是豬圓環(huán)病毒的一段主要抗原基因制備而成，沒有選用全病毒，這樣就避免了全病毒滅活疫苗在病毒培養(yǎng)過(guò)程中造成的異源病原污染風(fēng)險(xiǎn)和由于病毒滅活不徹底而造成散毒的風(fēng)險(xiǎn)。疫苗中的有效抗原是組裝成病毒樣顆粒的CAP蛋白，其病毒樣顆粒與天然豬圓環(huán)病毒的空間構(gòu)象及其相似，可以通過(guò)和天然病毒感染機(jī)體一樣的途徑遞程免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)全面的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，免疫原性明顯優(yōu)于傳統(tǒng)滅活疫苗。在制備過(guò)程中采用在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的CAP蛋白制備抗原，沒有培養(yǎng)全病毒、這樣就有效解決了豬圓環(huán)病毒滅活疫苗在培養(yǎng)病毒過(guò)程中血清蛋白、細(xì)胞碎片和在滅活過(guò)程中滅活劑等成分造成的免疫副反應(yīng)過(guò)大的困擾。該疫苗仔豬只需免疫1次，每次只需免疫1毫升，而傳統(tǒng)豬圓環(huán)病毒滅活疫苗仔豬需要免疫2次，每次需要免疫2ml。不但降低了免疫次數(shù)，而且減少了免疫劑量，即方便操作，也有效降低了免疫注射給豬群造成的應(yīng)激反應(yīng)。

焦點(diǎn)二：為何采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)？

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是通過(guò)DNA重組技術(shù)，在大腸桿菌中高效表達(dá)編碼病原微生物保護(hù)性抗原基因的一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)。是目前重組蛋白表達(dá)的最常用系統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的較早，具有背景清楚，操作簡(jiǎn)便，表達(dá)量高等諸多優(yōu)點(diǎn)。表達(dá)水平相對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)明顯更高，但也有相對(duì)應(yīng)的缺點(diǎn)，如大腸桿菌系統(tǒng)不能將表達(dá)蛋白分泌到胞外，二硫鍵的形成能力有限，不能實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)復(fù)雜修飾（如糖基化修飾等）。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)是利用攜帶有外源目的基因的重組昆蟲桿狀病毒作載體在昆蟲體內(nèi)或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)的一個(gè)重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。由于該系統(tǒng)所需要的周期遠(yuǎn)比動(dòng)物或植物系統(tǒng)短，可以利用昆蟲個(gè)體或其培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)生產(chǎn)，生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)量高，蛋白翻譯后加工比細(xì)菌、酵母生產(chǎn)系統(tǒng)完善，而且由于昆蟲桿狀病毒具有限制性的宿主范圍，只對(duì)特定種屬的昆蟲及其細(xì)胞進(jìn)行感染，對(duì)人畜等脊椎動(dòng)物沒有感染能力，因此具有比在哺乳動(dòng)物及其培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)更為安全等優(yōu)點(diǎn)而成為目前最有效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。（表1）

豬圓環(huán)病毒2型疫苗可以采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的原因是：豬圓環(huán)病毒2型全基因長(zhǎng)為1766-1768 bp，為目前已知感染豬群的最小的病毒之一。圓環(huán)病毒表面只存在一種結(jié)構(gòu)蛋白（cap蛋白），該蛋白不需要任何糖基化位點(diǎn)修飾，因此采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)從根本而言沒有任何差別。此外，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、周期短，成本低等優(yōu)點(diǎn)，所以在圓環(huán)病毒2型Cap蛋白表達(dá)時(shí)選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)更具有競(jìng)爭(zhēng)力。

焦點(diǎn)三：“圓柯欣”有哪些技術(shù)突破？

普萊柯生物自2010年上市國(guó)內(nèi)首個(gè)全病毒豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（SH株）之后，長(zhǎng)期致力于更高品質(zhì)圓環(huán)系列產(chǎn)品的研究與開發(fā)，新上市的豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗“圓柯欣”主要突破在于：突破了可溶性蛋白的表達(dá)、高純度Cap蛋白提取、病毒樣顆粒組裝3項(xiàng)核心技術(shù)。

1）可溶性蛋白的表達(dá)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其自身眾多的優(yōu)點(diǎn)而成為表達(dá)外源性蛋白的首選，但是外源蛋白在大腸桿菌表達(dá)過(guò)程中往往不能正確折疊而形成不溶的無(wú)活性蛋白，即包涵體。如何提Cap蛋白的可溶性表達(dá)，專家們進(jìn)行了深入的研究。在豐富的大腸桿菌表達(dá)技術(shù)儲(chǔ)備和完善的載體庫(kù)與基因庫(kù)基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析和基因重組克隆技術(shù)構(gòu)建、優(yōu)化和篩選表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的突破，使得可溶性Cap蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量有了質(zhì)的提升。

2）高純度Cap蛋白獲取

Cap蛋白經(jīng)過(guò)表達(dá)、粗純后，其中仍含有大量大腸桿菌的蛋白、核酸、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì)影響病毒樣顆粒的形成，導(dǎo)致產(chǎn)生不完整和不規(guī)整的顆粒，同時(shí)也會(huì)影響疫苗的免疫效力。獲取高純度的蛋白是做好疫苗的首要難點(diǎn)之一。

國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心多位專家經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，通過(guò)多重蛋白層析純化，獲得了高純度的Cap蛋白，將Cap蛋白的純度提高至95%以上，從而為后續(xù)高效的組裝完整的病毒樣顆粒奠定了基礎(chǔ)。（圖1，2）

3）病毒樣顆粒組裝

獲得了最基本的原料，如何將Cap蛋白組裝成有效的病毒樣粒子是核心技術(shù)。在以前的研究中，該難點(diǎn)是很多學(xué)者難以逾越的技術(shù)屏障。因?yàn)榻M裝條件不成熟，疫苗中Cap蛋白主要以單體或多聚體的形式存在或者部分組裝后的顆粒與PCV2病毒本身的大小、結(jié)構(gòu)存在差異，即使含量再高，也無(wú)法產(chǎn)生很高的抗體，對(duì)豬只無(wú)法進(jìn)行高效的保護(hù)。

國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心聯(lián)合新加坡國(guó)立大學(xué)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的技術(shù)攻關(guān)，通過(guò)切向流超濾等技術(shù)在特定的緩沖液中實(shí)現(xiàn)組裝。動(dòng)態(tài)光散射分析顯示將近100%的蛋白都組裝成病毒樣顆粒。通過(guò)投射電鏡，我們可以看到組裝成VLPs的真實(shí)面目：均一、完整的20nm左右的顆粒。（圖3）

國(guó)內(nèi)首個(gè)純病毒樣顆粒豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗（大腸桿菌源）一一“圓柯欣”的上市，將會(huì)加速推動(dòng)豬用疫苗產(chǎn)業(yè)進(jìn)入基因工程時(shí)代，在進(jìn)一步強(qiáng)化普萊柯在豬苗市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，引領(lǐng)我國(guó)動(dòng)物疫苗產(chǎn)業(yè)技術(shù)進(jìn)步，為我國(guó)家畜疫病防控及安全畜產(chǎn)品生產(chǎn)提供強(qiáng)有力的技術(shù)和產(chǎn)品支撐。