三黃瀉心湯對Ⅱ型糖尿病大鼠的降血糖作用研究

劉巧，胡慧玲，岳青，方明，王戰(zhàn)國

圖1 糖尿?。ㄏ剩┑闹嗅t(yī)治療模式圖 [10]

三黃瀉心湯始載于張仲景的《金匱要略》，由大黃、黃連、黃芩三味中藥組成[1]，在治療中醫(yī)消渴證（糖尿病）的臨床應用中療效明確，同時以其為基礎衍生的類方也廣泛用于消渴證（糖尿病）的臨床治療[2～3]。中華中醫(yī)藥學會2007年發(fā)布的《糖尿病中醫(yī)防治指南》總結出糖尿?。ㄏ首C）的中醫(yī)治療模式圖中，瀉心湯及類方具有重要貢獻[4]（見圖1）。研究證實三黃瀉心湯及所含中藥大黃、黃連、黃芩中化學成分均具有明確的抗 Ⅱ 型糖尿病的生物活性[5～9]。流行病學調查結果顯示糖尿病發(fā)病率日益提高，中國已成為世界糖尿病第一大國，成年人口發(fā)病率達11.6 %，糖尿病前期患者更是高達50.1%[11]。因此，本課題以三黃瀉心湯為研究對象，初步開展其對實驗性糖尿病大鼠的降血糖研究，以對后期的機制研究和臨床用藥進行指導。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級 SD 雄性大鼠 40 只，體重 90±10 g，購買自成都達碩生物科技有限公司，科技部實驗動物生產(chǎn)許可證編號： SCXK（川） 2011-20。

1.2 實驗儀器

HEM-112 歐姆龍血糖儀（歐姆龍自動化（中國）有限公司）；二型糖尿病大鼠造模實驗21BS-101 血糖試紙（歐姆龍自動化（中國）有限公司）；CX2000 動物秤（500 g ± 0.01 g）（CHANGXIE/長協(xié)電子有限公司）；YB-ZBJ-X40制冰機（上海億倍實業(yè)有限公司）；FA1004B 電子分析天平（上海平軒科學儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.3 試劑耗材

葡萄糖（成都市科龍化工試劑廠）；高脂高糖飼料[維持飼料65%，豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鈉1%，混調劑（雞蛋麻油花生）1.5%（北京博愛港商貿有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ）（北京博愛港商貿有限公司，批號：170226，純度≥98.5 %）；檸檬酸和檸檬酸鈉（北京博愛港商貿有限公司）；大黃藥材（四川省中藥飲片有限責任公司，批號：161010），黃連藥材（四川省中藥飲片有限責任公司，批號：170330），黃芩藥材（四川省中藥飲片有限責任公司，批號：160827），經(jīng)鑒定，藥材各項指標均符合《中華人民共和國藥典》2015 版規(guī)定項下要求；鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥公司，批號：AA07507，規(guī)格：0.85 g/片）。

2 試驗方法

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 三黃瀉心湯合煎液的制備 取大黃粉末120 g、黃連粉末60 g、黃芩粉末60 g（均過四號篩），精密稱定，以上三味，加入10倍量純水浸泡30 min后煎煮三次，第一次1.5 h，第二次1 h，第三次40 min，合并煎液，趁熱濾過，得煎煮液約800 mL。然后將400 mL煎煮液濃縮至200 mL后冷凍干燥得粉末54 g，計算粉末得率為22.5 %。臨用前用生理鹽水配置成濃度為56.25 mg粉末/mL的灌胃溶液（臨床劑量換算為1.5 g生藥/kg，每只給藥體積為2 mL），置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 鹽酸二甲雙胍溶液的制備 取鹽酸二甲雙胍片10片，加入243 mL 純水稀釋成35 mg·mL-1的灌胃溶液（臨床劑量換算為210 mg·kg-1，每只給藥體積為2 mL），置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 緩沖液的制備 取檸檬酸(FW:210.14) 2.1 g ，精密稱定，加入雙蒸水 100 mL 中配成 A 液；取檸檬酸鈉(FW:294.10) 2.94 g，精密稱定， 加入雙蒸水 100 mL 中配成 B 液；用時將 A、B 液按一定比例混合（1：1.32），pH 計測定 pH 值,調節(jié) pH =4.2～4.5，即是所需配置 STZ 的檸檬酸緩沖液。制備完成后抽濾，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 40%葡萄糖溶液的制備 取葡萄糖40 g ，精密稱定，加入生理鹽水100 mL 配制成40 %葡萄糖，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實驗設計

2.2.1 動物分組與飼養(yǎng)方法 實驗前適應飼養(yǎng)一周，給予標準光照周期（14 h 光照、10 h 黑夜），實驗室溫度維持在20～25 ℃，相對濕度控制在70 %左右。將大鼠隨機分為 4 組，每組 10 只，對其中3 組大鼠喂食高脂高糖飼料，另一組喂食普通飼料，不限制進食量，自由飲水。每周對大鼠進行進食量、飲水量和體重等基礎數(shù)據(jù)的測定。

2.2.2 STZ造模 對大鼠喂食高脂高糖飼料 1～2 月，誘導其產(chǎn)生胰島素抵抗，然后進行 STZ 注射。SD 大鼠隔夜禁食 12 h，不禁水，精密稱取大鼠體重，按照50 mg·kg-1給藥劑量設計藥物濃度及給藥體積。稱取 STZ 溶于配好的檸檬酸緩沖液中，渦旋至充分溶解，置于冰浴中，在 20 min 內快速完成大鼠腹腔注射。在造模后 2 h 可以正常喂食。

2.2.3 Ⅱ型糖尿病大鼠模型驗證 造模一月內，每周大鼠白天禁食 6 h，取尾部血液少許，使用歐姆龍血糖測試儀及歐姆龍血糖試紙進行血糖檢測，檢測大鼠空腹血糖（FBG），采用 FBG≥16.7 mmoL·L-1為判定標準，若大鼠血糖值高于標準，則初步判定糖尿病大鼠高血糖模型造模成功。

葡萄糖耐受試驗（OGTT）：實驗大鼠隔夜禁食12 h 以上，腹腔注射 2 g·kg-1的 40%的葡萄糖溶液，在 0、30、 60 、90 和 120 min 的時候采集尾靜脈血，測量并記錄其血糖值，然后計算相應的曲線下面積（AUC）。

2.2.4 給藥方法和分組 將模型成功的糖尿病大鼠24 只，隨機分為三黃瀉心湯組（XXD）、二甲雙胍陽性藥組（MH）、模型組（DM）3 組，“2.3.1”項下喂食普通飼料的大鼠設為正常組（NC），每組8只。每組分別給予相應藥物 2 mL/只/d，正常組和模型組給予等量的生理鹽水。于給藥后每周測量大鼠體重，飲水量，進食量等，于給藥每兩周測量大鼠空腹血糖（FBG），于給藥每四周測定大鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）。

2.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以( ±s)表示，組間比較用t 檢驗，P＜0.05 為數(shù)據(jù)統(tǒng)計有統(tǒng)計學意義。

3 試驗結果

3.1 Ⅱ型糖尿病大鼠模型驗證

造模一月后，與正常大鼠相比，造模后的大鼠體重增幅較小，甚至有所下降，血糖值均高于FBG≥16.7 mmol·L-1，尿量明顯增加，飲水量和進食量明顯高于正常組。此結果符合糖尿病大鼠“三多一少”的特點，初步判定二型糖尿病造模成功。由圖1可知實驗糖尿病大鼠在 2 h 內對葡萄糖表現(xiàn)出耐受，表明二型糖尿病造模成功，可進行下一步的實驗。

圖1 三黃瀉心湯給藥前對糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影響

3.2 體重

實驗組大鼠從購入到治療結束共計18 w，本實驗記錄了18 w大鼠的體重變化（表1）。由表1 可以看出，造模前 SD 大鼠的體重始終呈現(xiàn)增加趨勢，造模后其趨勢放緩，并在造模后(7～10 w)體重出現(xiàn)降低。給藥 8 w 后（即11～16 w），NC組大鼠體重平均增加了135 g，XXD 組、 MH 組和 DM組體重均沒有正常組增加快， XXD組體重平均增加了 32 g，MH 組體重平均增加了 9 g，DM組大鼠體重平均增加了49 g；與正常組比較均表現(xiàn)出極顯著的統(tǒng)計學差異（P＜0.001）。

表1 大鼠體重記錄（x±s，n=8；單位：g）

注：與NC組比較，*P＜0.05 , **P＜0.01, ***P＜0.001

3.3 飲水量

糖尿病大鼠由于血糖升高導致尿糖增加，尿糖增加引起尿滲透壓升高，滲透利尿引發(fā)多尿現(xiàn)象，多尿再引起體內血容量減少，進而引起血漿滲透壓升高，刺激口渴中樞，引起口渴，并導致多飲。由表2可以明顯看出，在造模后，大鼠的飲水量出現(xiàn)了明顯的增加，平均模型組每組每只大鼠的飲水量比正常組平均增加了約75～125 mL。給藥8 w，正常大鼠的飲水量基本保持在一個較穩(wěn)定的狀態(tài)，DM組飲水量有下降趨勢，每只模型大鼠的飲水量平均減少了40 mL ；而XXD組每只大鼠的飲水量平均減少了71 mL，MH組每只大鼠的飲水量平均減少了75 mL，兩組的飲水量均表現(xiàn)出明顯的降低趨勢，具有極顯著差異（P＜0.001）。

表2 給藥后大鼠飲水量記錄（x±s，n=8；單位：mL）

3.4 進食量

由于大量的排尿，導致體內糖分丟失嚴重，機體始終處于饑餓狀態(tài)，因此導致糖尿病患者多食多餐。由表3可知，給與 STZ 造模后，大鼠進食量增加。給藥8 w，正常大鼠的進食量基本保持在一個較穩(wěn)定的狀態(tài)，DM組大鼠進食量平均增加了1.1 g；而XXD組大鼠進食量平均減少了6.1 g，MH組大鼠進食量平均減少了12.3 g，兩組的進食量均表現(xiàn)出明顯的降低趨勢，具有極顯著差異（P＜0.001）。

表3 給藥后每組每只大鼠進食量記錄（x±s，n=8；單位：g）

3.5 空腹血糖 FBG

對大鼠采用白天禁食 6～8 h，取其尾靜脈血，測定其空腹血糖濃度。由表4可知，采用50 mg·kg-1的 STZ 對大鼠進行糖尿病造模，在一個月內可以達到預期水平，實驗大鼠基本處于高血糖狀態(tài)。給藥8 w，正常大鼠的進食量基本保持在一個較穩(wěn)定正常血糖值的狀態(tài)（5～7 mmol·L-1），DM組大鼠空腹血糖值平均降低了4.1 mmol·L-1，有一定程度的降低趨勢；而XXD組大鼠空腹血糖值平均降低了7.5 mmol·L-1，MH組大鼠空腹血糖值平均降低了7.1 mmol·L-1，兩組的FBG均表現(xiàn)了明顯的降低趨勢，具有極顯著差異（P＜0.001）。

表4 給藥后大鼠空腹6h血糖記錄(x±s，n=8；單位：mmol·L-1)

3.6 大鼠口服葡萄糖耐量

葡萄糖耐受表明了身體對血糖濃度的調節(jié)能力，正常情況下，機體攝入葡萄糖后，或誘導胰島素的分泌，進而達到降低血糖的目的，然而，糖尿病患者體內由于胰島素的相對或者絕對缺乏，導致其降血糖能力大大降低。因此，在給予葡萄糖注射后，其血糖會出現(xiàn)久高不下的現(xiàn)象。在給藥0、4、8 w將實驗大鼠隔夜禁食12 h后，給予每組大鼠灌胃40%的葡萄糖溶液，然后測定0，30，60，90，120 min內大鼠的血糖值，觀察其葡萄糖耐受能力。由圖2可知，正常對照組大鼠糖耐量正常，口服葡萄糖后，其血糖值在 30 min 達到峰值，隨后逐漸下降，并在120 min內恢復到正常水平；模型組糖尿病大鼠血糖值在 30 min 也達到峰值，但其后一直維持在較高水平（≥20 mmol·L-1），表明其糖耐量受損，說明胰島素的作用減弱，可能是由于胰島素缺乏或者是胰島素敏感性降低導致。與模型組糖尿病大鼠比較，灌胃三黃瀉心湯和二甲雙胍 8 w后，其血糖值在 30 min達到峰值，隨后以較快速度下降，但未能恢復到初始水平，表明三黃瀉心湯和二甲雙胍可改善糖尿病大鼠的糖耐量。由圖3可知，糖尿病模型組大鼠較正常組大鼠AUC增加了4.77倍，而灌胃三黃瀉心湯和二甲雙胍8 w后其AUC分別降低了11.72%和13.23%（P＜0.05），進一步證實了三黃瀉心湯對實驗性糖尿病大鼠機體糖代謝紊亂的改善作用。

圖2 三黃瀉心湯對糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影響

圖3 三黃瀉心湯給藥8w對糖尿病大鼠口服葡萄糖耐量的影響

4 討論

4.1 高糖高脂飼料+鏈脲佐菌素所致的糖尿病大鼠模型成功

糖尿病是當今世界備受關注的重大慢性疾病，其發(fā)病人數(shù)多，范圍廣，在世界范圍內共計有超過4億人患有糖尿病，其中 90%以上為Ⅱ 型糖尿病[11～12]。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，由于現(xiàn)代社會人們生活水平的提升，飲食習慣更偏向于肉食的轉變，工作壓力的增加以及身體鍛煉的缺乏，導致Ⅱ型糖尿病發(fā)病率極高，在中國有近1億的成年人患有Ⅱ 型糖尿病，老年患病人數(shù)尤甚。在藥理、藥效、藥物代謝的研究過程中，因為需要更好的貼近實際情況，常常采用相對應的病理動物模型進行研究。本實驗旨在通過鏈脲佐菌素（STZ）結合高熱量飼料建立一種Ⅱ型糖尿病大鼠模型的構建方法。實驗選取 90±10 g 的SD 雄性大鼠作為實驗對象，采用高脂高糖飼料喂食一月，誘導其產(chǎn)生胰島素抵抗，然后腹腔注射50 mg·kg-1的 STZ，繼續(xù)喂食高脂高糖飼料一月后，對模型進行驗證，主要檢測指標包括體重、飲水量、進食量、空腹血糖濃度和口服葡萄糖耐受。實驗結果表明，此劑量下的STZ 對實驗大鼠的毒害作用適中，導致的死亡率不足 10%。通過對其體重、飲水量、進食量的長期監(jiān)控，以及觀察其排尿量，造模后的大鼠出現(xiàn)了典型的“三多一少”癥狀，這一點符合糖尿病癥狀。模型大鼠空腹血糖始終高于正常水平，在造模4 w 后，其平均血糖濃度高于 20 mmol·L-1。高血糖意味著糖尿病的產(chǎn)生，因此實驗方法能夠建立科學合理的Ⅱ 型糖尿病大鼠模型。

4.2 三黃瀉心湯對Ⅱ 型糖尿病大鼠的降血糖作用研究

本課題采用三黃瀉心湯臨床治療糖尿病的劑量來開展實驗性糖尿病模型大鼠的降血糖研究，通過8 w 的治療時間發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠空腹血糖和口服葡萄糖耐量得到了顯著的改善，體重也有所增加。因此，三黃瀉心湯對Ⅱ 型糖尿病大鼠具有明顯的降血糖作用。但是降血糖并不是糖尿病的唯一指標，因此本實驗后續(xù)還要開展三黃瀉心湯對糖尿病大鼠的降血糖的機制研究，以及相關病理學指標研究，以期綜合評價三黃瀉心湯對實驗性糖尿病大鼠的降血糖作用。

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