一種苯并咪唑酮類GSK-3抑制劑的純度研究

陳換飛，鄒靜，白蘭，賈貴清，彭婷，陳婷，吳小愚，張梅

目前，腫瘤作為影響人類健康的世界性難題，一直是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。新型安全、高效、副作用小的抗腫瘤藥物的研發(fā)則顯得意義重大。糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一種多功能的絲氨酸蘇氨酸類蛋白激酶，當(dāng)其在體內(nèi)異常表達(dá)時，引發(fā)糖尿病、阿爾茲海默癥以及直腸癌、胃癌等多種癌癥[1,2]。因此，GSK-3已成為抗腫瘤作用研究的熱門靶點(diǎn)，其相應(yīng)的小分子抑制劑研究是抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。

Dibromophakellstatin是從Phakellia mauritiana分離的一種天然產(chǎn)物，其作為新型的抗腫瘤抑制劑，具有苯并咪唑-2-酮支架[3]。近年來相關(guān)研究也表明，具有苯并咪唑-2-酮結(jié)構(gòu)的活性化合物，可以作為酯酶抑制劑、抗菌劑等[4-5]。其中如halopemide、UV0155069等作用于不同的腫瘤靶點(diǎn)時均有顯著抗腫瘤活性[6-11]。因此，二氫苯并咪唑-2-酮被用作抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的新型支架，受到越來越多的關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)二氫苯并咪唑-2-酮類化合物潛在的抗腫瘤活性，綜合分析目前已報道的具有良好抗腫瘤作用的GSK-3小分子抑制劑如SB216763[12]、Azakenpaulllone[13]、compound 6h[14]的結(jié)構(gòu)（IC50及結(jié)構(gòu)見圖1），發(fā)現(xiàn)GSK-3抑制劑大多具有酰胺或內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。且鑒于磺酰胺基團(tuán)常作為重要藥效基團(tuán)出現(xiàn)在抗腫瘤藥物中，本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中，通過在5位引入磺酰胺基團(tuán)，設(shè)計和合成了一系列新型GSK-3抑制劑—苯并[d]咪唑-2（3H）-酮衍生物（化合物5a-o）。相關(guān)體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，化合物5a-o對人乳腺癌細(xì)胞HCC1937、MDA-MB-468、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549三種不同組織來源的腫瘤細(xì)胞具有不同程度的增殖抑制作用，其中化合物5b（結(jié)構(gòu)見圖1）在這三種腫瘤細(xì)胞中均具有良好的抗腫瘤活性，其IC50分別為2.6 μM，3.1 μM，6.3 μM。因此建立一種簡便可行的純度分析測定方法，對于GSK-3小分子抑制劑化合物的合成、純度測定以及后續(xù)的相關(guān)開發(fā)研究具有重要意義。

圖1 部分文獻(xiàn)報道的GSK-3抑制劑（a,b,c）及化合物5b結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[15,16]，采用高效液相色譜法，對化合物5b的純度進(jìn)行監(jiān)測，指導(dǎo)其化學(xué)合成。其合成路線如圖2所示。

圖2 苯并[d]咪唑-2（3H）-酮衍生物（化合物5a-o）的合成路線

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（e2695, 美國waters公司）；PDA檢測器（2998, 美國waters公司）；超聲清洗儀（KQ-2200, 昆山超聲儀器）；電子天平（JA1003，上海順宇恒平科學(xué)儀器）；實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)（KMUPT-8/15/20, Millipore）。

1.2 試劑

化合物5b屬于本實(shí)驗(yàn)室自行合成的新型抗腫瘤藥物，無市售對照品?；衔?b對照品由本實(shí)驗(yàn)室前期合成，采用高效液相色譜面積歸一化法對化合物5b的純度進(jìn)行檢測。根據(jù)面積歸一化法，計算得化合物5b的相對含量為98.14%，符合對照品的含量要求（大于98%）。 色譜甲醇，購自阿拉丁試劑公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)制備。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18110A色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇∶水（75∶25）；流速1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1對照品溶液的制備 取化合物5b對照品10 mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解，定容至10 mL，精密量取1 mL該對照品溶液，稀釋至0.1 mg·mL-1，0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液用于HPLC進(jìn)樣分析。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 取化合物5b供試品1 mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解，定容至10 mL，精密量取1 mL該對照品溶液，稀釋至0.1 mg·mL-1，0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液用于HPLC進(jìn)樣分析。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取化合物5b對照品溶液稀釋成濃度分別為100、80、60、40、20 μg·mL-1的對照品溶液，按照上述色譜條件分別進(jìn)樣分析,并記錄相應(yīng)峰面積，以化合物5b的檢測濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。

1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0，4，8，12，16，20，24 h時依照上述方法進(jìn)樣測定。

1.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品，分別依法制備6份供試品溶液并測定含量。

1.3.3.5 加樣回收試驗(yàn) 稱取6份同一批已知含量為981 mg·g-1的樣品1.020 mg，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入1 mg·mL-1化合物5b對照品溶液 0.8，1.0，1.2 mL，依“1.3.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測定，并計算回收率。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

線性回歸考察結(jié)果如圖3所示，回歸方程為Y=3.53×107X+52087，r=0.9999（n=5），結(jié)果表明，化合物5b在20～100 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖3 化合物5b標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密度試驗(yàn)，峰面積的平均值為5374093，RSD為0.63%（n=6），結(jié)果表明方法精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，峰面積的平均值為5369442，RSD為0.94%（n=7），表明供試品溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定，符合測量要求；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，化合物5b平均含量為847 mg·g-1，RSD為0.52%（n=6），方法重復(fù)性良好；加樣回收試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，化合物5b平均回收率為100.44 %，RSD為0.78 %（n=6）。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 化合物5b加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

1.0 1.0 2.012 101.22 1.0 1.0 2.005 100.47 100.44 0.78 1.0 1.2 2.205 100.38 1.0 1.2 2.195 99.62

2.2 樣品測定結(jié)果

取三批合成所得產(chǎn)品，依法測定，測得化合物5b的含量分別為984 mg·g-1、990 mg·g-1、981 mg·g-1，計算結(jié)果顯示，所合成的化合物5b純度達(dá)98%以上，純度較高。高效液相色譜圖見圖4。

圖4 化合物5b HPLC圖（A.對照品 B.供試品）

3 討論

HPLC是基于經(jīng)典液相色譜法而迅速發(fā)展起來的可以快速高效分析樣品的方法。本實(shí)驗(yàn)從化合物5b的物理性質(zhì)以及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器設(shè)備條件和可操作性等方面考慮，選擇了可操作性強(qiáng)、分析速度快、精度高的高效液相色譜法來對化合物5b的純度進(jìn)行測定，并對測定方法進(jìn)行了考察。

根據(jù)GSK-3抑制劑—苯并咪唑酮衍生物的合成路線，我們推測可能在b,c及d反應(yīng)過程中，由于硝基為間位定位基，而氨基為鄰對位定位基，因此反應(yīng)中除了在間位生成主產(chǎn)物化合物5b外，也可能會生成鄰位的副產(chǎn)物，且磺酰氯自身也會發(fā)生相應(yīng)副反應(yīng)。另外，在整個反應(yīng)過程中，由于步驟較多，也會在反應(yīng)及后處理過程中引入其他雜質(zhì)。因此，為了獲得結(jié)構(gòu)正確，純度合格的化合物5b，作者首先對化合物5b結(jié)構(gòu)進(jìn)行1H-NMR，13C-NMR鑒定，在1H-NMR圖譜中發(fā)現(xiàn)帶磺酸基的苯環(huán)上3個氫，其中有一個是單峰（s），另外兩個成雙重峰(d)，并沒有發(fā)現(xiàn)這三個氫的其他裂峰情況，表明該化合物就是目標(biāo)化合物5b，并沒有生成鄰位的副產(chǎn)物。同時13C-NMR結(jié)果亦顯示化合物5b結(jié)構(gòu)正確。其次，將化合物5b對照品進(jìn)行全波長掃描，掃描結(jié)果顯示其在254 nm處有最大吸收，靈敏度最高且其余物質(zhì)對化合物5b的吸收影響最小，因此選擇254 nm為測定波長。試驗(yàn)中分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水等不同流動相體系，考察結(jié)果表明采用甲醇-水體積比為75∶25作為流動相時，柱效較高且具有較好的分離度，故選擇甲醇-水（75∶25）作為化合物5b純度測定的流動相體系。本試驗(yàn)亦對該分析方法的專屬性進(jìn)行了考察，原料對化合物5b的測定無干擾且繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.9999，表明此化合物20～100 μg·mL-1在線性關(guān)系良好。加樣回收率能夠反映分析方法在確定分析條件下樣本濃度測定的準(zhǔn)確性，一般樣品的回收率宜在85%～115%的范圍內(nèi)，本試驗(yàn)的平均加樣回收率達(dá)到100.44 %，RSD為0.78 %，表明該分析方法測定結(jié)果具有較高準(zhǔn)確度。另外，精密度試驗(yàn)中的RSD值為0.63 %，說明實(shí)驗(yàn)方法具有良好的精密度。

綜上所述，HPLC測定化合物5b的純度，具有操作簡便，準(zhǔn)確度高，分離度好等特點(diǎn)，符合HPLC的測定要求，可以用于監(jiān)測的化學(xué)合成反應(yīng)進(jìn)程和檢測GSK-3抑制劑苯并咪唑酮系列衍生物的純度。

[1]D W, W P.GSK3: a multifaceted kinase in Wnt signaling [J].Trends Biochem Sci, 2010, 35(3): 161.

[2]JEONG W J, YOON J, PARK J C, et al.Ras stabilization through aberrant activation of Wnt/β-catenin signaling promotes intestinal tumorigenesis [J].Sci Signaling, 2012, 5(219): ra30.

[3]CAFIERI F, FATTORUSSO E, MANGONI A.ChemInform Abstract: Longamide and 3,7-Dimethylisoguanine, Two Novel Alkaloids from the Marine Sponge Agelas longissima [J].Cheminform, 1996, 27(6): 7893.

[4]BUDZIK B, GARZYA V, SHI D, et al.Novel N-Substituted Benzimidazolones as Potent, Selective, CNS-Penetrant, and Orally Active M1 mAChR Agonists [J].Acs Med Chem Lett,2010, 1(6): 244.

[5]LI S K, JI Z Q, ZHANG J W.Synthesis of 1-acyl-3-isopropenyl benzimidazolone derivatives and their activity against Botrytis cinerea [J].J Agric Food Chem, 2010, 58(5): 2668.

[6]SCOTT S A, SELVY P E, BUCK J R, et al.Design of isoformselective phospholipase D inhibitors that modulate cancer cell invasiveness [J].Nat Chem Bio, 2009, 5(2): 108.

[7]COLLINS J C, ARMSTRONG A, CHAPMAN K L, et al.Prospective use of molecular field points in ligand-based virtual screening: efficient identification of new reversible Cdc25 inhibitors [J].Medchemcomm, 2013, 4(8): 1148.

[8]BRUNCKO M, TAHIR S K, SONG X, et al.N -Arylbenzimidazolones as novel small molecule HSP90 inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett, 2010, 20(24): 7503.

[9]WU Z, ROBINSON R G, FU S, et al.Rapid assembly of diverse and potent allosteric Akt inhibitors [J].Bioorg Med Chem Lett, 2008, 18(6): 2211.

[10]BALLANTE F, CAROLI A, RAGNO R.Hsp90 inhibitors,part 1: definition of 3-D QSAutogrid/R models as a tool for virtual screening [J].J Chem Inf Model, 2014, 54(3): 956.

[11]RZASA R M, KALLER M R, LIU G, et al.Structure–activity relationships of 3,4-dihydro-1 H -quinazolin-2-one derivatives as potential CDK5 inhibitors [J].Bioorg Med Chem, 2007, 15(20):6574.

[12]張娜, 蔣勇軍, 俞慶森, 等.GSK-3抑制劑研究進(jìn)展 [J].化學(xué)進(jìn)展, 2007, 19(4): 614.

[13]KUNICK C, LAUENROTH K, LEOST M, et al.1-Azakenpaullone is a selective inhibitor of glycogen synthase kinase-3 beta [J].Cheminform, 2004, 14(2): 413.

[14]Shin D, Lee S C, Heo Y S, et al.Design and synthesis of 7-hydroxy-1H-benzoimidazole derivatives as novel inhibitors of glycogen synthase kinase-3beta.[J].Bioorg Med Chem Lett, 2007, 17(20):5686.

[15]王鑫, 李善茂, 李偉, 等.甲氟磷酸異丙脂的純度測定 [C].公共安全中的化學(xué)問題研究進(jìn)展,2011 .

[16]諶喜珠, 劉洋, 劉偉平.抗癌藥順鉑對照品制備及其純度測定 [J].分析試驗(yàn)室, 2008, 27(2):46.