從抗炎鎮(zhèn)痛解熱作用初步探究三黃瀉心湯復(fù)方合煎制備工藝科學(xué)內(nèi)涵

陳哲杰，王靜，甘帥，李杰，王瀟，成彥芬，李文*

三黃瀉心湯又名“三黃湯”“伊尹三黃湯”，全方由大黃、黃連、黃芩組成，大黃為君藥，導(dǎo)熱下行，以瀉代清，止血而不留瘀，主瀉下焦之火。黃連、黃芩具清熱燥濕、瀉火解毒之功，分清上、下焦之火，共為臣藥，輔助大黃。三藥配伍，既相互策應(yīng)又各有側(cè)重，直清上、中、下三焦之火。三黃瀉心湯為中醫(yī)臨床治療火熱壅盛、吐衄之經(jīng)方?，F(xiàn)代有研究認(rèn)為三黃瀉心湯復(fù)方合煎會(huì)產(chǎn)生大量沉淀物[1]，并且影響三黃瀉心湯所含藥材有效物質(zhì)的溶出率[2]。然而亦有研究證實(shí)三黃瀉心湯復(fù)方合煎所產(chǎn)生的沉淀物具有與湯液一樣的生理活性，應(yīng)將沉淀看作其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的一部分加以利用[3]。傳統(tǒng)三黃瀉心湯亦有“頓服”的要求，《簡(jiǎn)明中醫(yī)辭典》認(rèn)為“頓服”為將藥液一次性較快的服下，這樣使得三黃瀉心湯所含沉淀物能在胃腸被人體吸收利用。目前應(yīng)用于中醫(yī)臨床的傳統(tǒng)三黃瀉心湯湯劑仍采用以水為溶媒的復(fù)方合煎制備，然而相關(guān)中成藥開發(fā)過程中，為避免藥材復(fù)方合煎過程中有效成分產(chǎn)生“絮狀物”被除去，放棄了沿用千年的三黃瀉心湯制備古法，采用分煎藥材的制備工藝。

三黃瀉心湯臨床主要用于火熱壅盛所致諸癥的治療。現(xiàn)代研究表明，火熱壅盛可引起諸多身體病理反應(yīng)，其中與炎癥、疼痛、體溫升高關(guān)系密切[4]。故本文以最為簡(jiǎn)單、最為直接的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)作為對(duì)三黃瀉心湯處方藥材單煎液、分煎合并液、合煎液藥理作用差異評(píng)價(jià)切入點(diǎn)，在不去除各組湯液沉淀的情況下，模仿傳統(tǒng)三黃瀉心湯“頓服”用法分別對(duì)動(dòng)物進(jìn)行給藥，通過對(duì)各組的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用差異研究，以期初步探究三黃瀉心湯復(fù)方合煎的科學(xué)內(nèi)涵，為該方在現(xiàn)代研究與制劑開發(fā)中制備工藝的確定提供相關(guān)參考。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

大黃Rheum offcinaleBaill.（批號(hào)：G00216P01）、黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi（批號(hào)：G03816L01）、黃連CoptischinensisFranch.（批號(hào)：G03616P01）均購(gòu)自四川中庸藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢查藥材的各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015版規(guī)定項(xiàng)下要求。阿司匹林腸溶片（批號(hào)：170202）購(gòu)自北京中新藥業(yè)股份有限公司；大鼠超氧化物歧化酶（SOD，批號(hào)：20171109）、大鼠丙二醛（MDA，批號(hào)：20171027）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號(hào)：238270925）購(gòu)自聯(lián)科生物；大鼠前列腺素E2（PGE2，批號(hào)：C0189020116）購(gòu)自華美生物；角叉菜膠（批號(hào)：10013887572）、內(nèi)毒素（批號(hào)：0599234）購(gòu)自于Sigma公司；干酵母（批號(hào)：20170728）購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司、購(gòu)自于Sigma公司；二甲苯、冰醋酸均購(gòu)置于四川科龍化工試劑廠。

1.2 試驗(yàn)儀器

Neofuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Heal Force公司）；Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Forma-86C超低溫冰箱（美國(guó)Thermo集團(tuán)）；Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTeK公司）；DY89-Ⅱ電動(dòng)勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；PL-203MC-34電子體溫計(jì)（歐姆龍大連有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，體重200±20g；昆明種小鼠，體重20±2g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。動(dòng)物購(gòu)入后檢疫與馴化飼養(yǎng)7 d，使其適應(yīng)新環(huán)境并剔除體質(zhì)量差異較大的動(dòng)物，并在室溫18～24 ℃、濕度40%～50%條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，晝夜節(jié)律正常。

2 方法

2.1 受試藥物的制備

2.1.1 三黃瀉心湯合煎液的制備 大黃100 g、黃芩50 g、黃連50 g，用8倍量水加熱回流提取3次，每次1h，合并提取液，濃縮至500 mL，即生藥計(jì)量為0.4 g·mL-1。按古方成人日服三黃瀉心湯處方生藥劑量為60 g計(jì)[5]，通過換算確定小鼠灌胃劑量為22.75 mL·kg-1(按生藥計(jì)為9.1 g·kg-1）。大鼠的灌胃劑量為15.75 mL·kg-1（按生藥計(jì)為6.3 g·kg-1）。

2.1.2 三黃瀉心湯分煎合并液的制備 大黃100 g、黃芩50 g、黃連50 g，分別用8倍量水加熱回流提取3次，每次1 h，分別濃縮后冷卻致室溫后合并煎液并定容至500 mL，即生藥計(jì)量為0.4 g·mL-1。同“2.1.1”項(xiàng)下，通過換算確定小鼠灌胃量為22.75 mL·kg-1(按生藥計(jì)為9.1 g·kg-1）。大鼠的灌胃劑量為15.75 mL·kg-1（按生藥計(jì)為6.3 g·kg-1）。

2.1.3 藥材單煎液的制備 大黃100 g、黃芩50 g、黃連50 g，分別用8倍量水加熱回流提取3次，每次1 h，分別濃縮后冷卻致室溫后分別濃縮至500 mL。每種單煎液劑量為小鼠灌胃量為22.75 mL·kg-1(按生藥計(jì)分別為4.55 g·kg-1、2.275 g·kg-1、2.275 g·kg-1）。大鼠的灌胃計(jì)量為15.75 mL·kg-1（按生藥計(jì)分別為3.15 g·kg-1、1.575 g·kg-1、1.575 g·kg-1）。

2.1.4 阿司匹林溶液的制備 取阿司匹林腸溶片適量，于研缽碾碎，加入適量純水繼續(xù)碾磨，將阿司匹林腸溶片配置為濃度為0.014 g·mL-1的溶液，小鼠灌胃劑量為14.29 mL·kg-1，（按阿司匹林腸溶片計(jì)算為0.2 g·kg-1）。大鼠的灌胃劑量為10 mL·kg-1，（按阿司匹林腸溶片計(jì)算為0.14 g·kg-1）[6]。

2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗(yàn)

取雄性昆明種小鼠70只，隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為生理鹽水組、阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組、大黃組、黃連組、黃芩組、三黃瀉心湯分煎合并組、三黃瀉心湯合煎組，各給藥組灌胃相應(yīng)體積藥物，生理鹽水組灌胃相應(yīng)體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d，于末次給藥后30 min，用二甲苯30 μL均勻涂抹每只鼠左耳兩面致炎，右耳作為對(duì)照。致炎15 min脫頸椎處死小鼠，以6 mm直徑打孔器取下耳緣左、右耳片，精密稱取質(zhì)量，以左、右耳片質(zhì)量差表示腫脹度，并計(jì)算腫脹抑制率[7]。

腫脹度=左耳耳片質(zhì)量(mg)－右耳耳片質(zhì)量(mg)

2.3 角叉菜膠致大鼠足腫脹試驗(yàn)

將80只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為正常組、生理鹽水組、阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組、大黃組、黃連組、黃芩組、三黃瀉心湯分煎合并組、三黃瀉心湯合煎組，各藥物組灌胃相應(yīng)體積的藥物，正常對(duì)照組與生理鹽水組灌胃相應(yīng)體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后測(cè)定右足跖致炎前的體積并于30 min后，在各組大鼠右后足跖皮下注射1 %角叉菜膠0.1 mL致炎（正常組大鼠除外），在致炎后3 h用足容積測(cè)量器測(cè)定右足趾致炎后的體積，以致炎前后體積差為足趾腫脹度。大鼠股動(dòng)脈取血后全血3000 r·min-1離心15 min，取上層血清置于4 ℃冰箱中冷藏備用，按照試劑盒說明書對(duì)血清中MDA、SOD進(jìn)行檢測(cè)。脫頸椎處死大鼠，并剪下大鼠炎癥右后足，稱量質(zhì)量，以預(yù)冷的生理鹽水為勻漿介質(zhì)，制備成10%的組織勻漿，于4℃下3000 r·min-1離心15 min，取上清液待用，后按照試劑盒操作說明書對(duì)炎癥組織中PGE2、TNF-α進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 小鼠醋酸扭體試驗(yàn)

取雄性昆明種小鼠70只，體重20±2 g，分組及給藥同“2.2”項(xiàng)下，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，各組小鼠腹腔注射1 %冰醋酸溶液10 mL·kg-1，觀察15 min 內(nèi)小鼠的扭體反應(yīng)(小鼠腹部?jī)?nèi)凹，后肢與軀干伸張，同時(shí)臀部高起)次數(shù)，并計(jì)算鎮(zhèn)痛率。

2.5 小鼠熱板試驗(yàn)

取雌性昆明種小鼠70只，體重20±2 g，分組及給藥同“2.2” 項(xiàng)下。小鼠置(55 ±0.5) ℃水浴的鋁盤上，以舔后足及抬后足并回頭為痛反應(yīng)指標(biāo)，記錄痛反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間（痛閾值），測(cè)定2次平均值在5～30 s之間且不跳躍的小鼠供實(shí)驗(yàn)用。并將平均值作為給藥前痛閾值。連續(xù)給藥7 d。末次給藥后以同樣方法測(cè)定30、60、90 min各小鼠的痛閾值，痛閾值若超過60 s則以60 s計(jì)，計(jì)算各組小鼠的痛閾提高率。

痛閥反應(yīng)提高百分率=(給藥后痛反應(yīng)時(shí)間-藥前痛反應(yīng)時(shí)間)/給藥前痛反應(yīng)時(shí)間×100%

2.6 內(nèi)毒素致大鼠發(fā)熱實(shí)驗(yàn)

雄性SD大鼠70只，體重200±20 g，先測(cè)定體溫2 d，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日測(cè)定基礎(chǔ)體溫2次，篩選2次基礎(chǔ)體溫差值＜0.3 ℃的大鼠供實(shí)驗(yàn)用，并取其平均值作為基礎(chǔ)體溫，合格大鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為生理鹽水組、阿司匹林陽(yáng)性對(duì)照組、大黃組、黃連組、黃芩組、三黃瀉心湯分煎合并組、三黃瀉心湯合煎組，各給藥組灌胃相應(yīng)體積的藥物1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h各組大鼠均腹腔注射內(nèi)毒素80 μg·kg-1，測(cè)定注射內(nèi)毒素后1、2、3、4、5 h大鼠體溫，計(jì)算各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的體溫變化。

2.7 干酵母致大鼠發(fā)熱實(shí)驗(yàn)

雄性SD大鼠70只，體重200±20 g，實(shí)驗(yàn)前用電子體溫計(jì)測(cè)量正常肛溫3次，取3次平均值作為大鼠的基礎(chǔ)體溫，選取體溫在36～38 ℃的大鼠，分組及給藥同“2.6” 項(xiàng)下，給藥7 d，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天于背部皮下注射20%酵母懸液10 mL·kg-1。測(cè)定給藥后1、2、3、4、5、6 h大鼠體溫，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠體溫變化[8]。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)以表示。模型組與各劑量組間的比較采用方差分析LSD法，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，與生理鹽水組小鼠相比，黃連單煎液對(duì)二甲苯所致的小鼠耳腫脹無明顯的抑制作用，大黃單煎液、黃芩單煎液對(duì)小鼠耳腫脹具有一定的抑制作用（P＜0.05）；三黃瀉心湯合煎液與分煎合并液均能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹（P＜0.01），但三黃瀉心湯合煎液的抑制效果要優(yōu)于三黃瀉心湯分煎合并液。

表1 各組對(duì)二甲苯致小鼠耳腫的影響（x±s, n=10）

表2 各組對(duì)角菜叉膠致大鼠足腫脹的影響（x±s, n=10）

3.2 角叉菜膠致大鼠足腫脹試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，與正常組大鼠相比，生理鹽水組大鼠足腫脹度顯著升高（P＜0.01），血漿中的SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），炎癥組織中TNF-α、PGE2的含量顯著升高（P＜0.01）。與生理鹽水組大鼠相比，黃連單煎液、黃芩單煎液不能有效抑制角叉菜膠引起的大鼠足腫脹，大黃單煎液不能顯著的提高大鼠血漿中SOD的活性；三黃瀉心湯合煎液能顯著提高大鼠血清中SOD活性（P＜0.01），但分煎合并液未能顯著提高大鼠SOD活性。此外三黃瀉心湯合煎液與分煎合并液均能顯著降低大鼠血清中MDA含量（P＜0.01），并能顯著減少炎癥組織中TNF-α、PGE2含量（P＜0.01）。三黃瀉心湯分煎合并液與合煎液相比在抑制大鼠足腫脹、提高SOD活性、降低TNF-α含量方面均不如合煎液，且存在顯著性差異（P＜0.05）。

3.3 小鼠醋酸扭體試驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，與生理鹽水組相比，大黃單煎液、黃連單煎液灌胃能降低醋酸腹腔注射所引起的小鼠扭體反應(yīng)（P＜0.01），但黃連單煎液對(duì)小鼠醋酸腹腔注射所致的扭體反應(yīng)抑制效果不明顯；三黃瀉心湯合煎液與三黃瀉心湯分煎合并液均能顯著的降低醋酸腹腔注射所致的小鼠扭體反應(yīng)（P＜0.01），但三黃瀉心湯合煎液對(duì)小鼠醋酸腹腔注射所致的扭體反應(yīng)抑制效果要優(yōu)于三黃瀉心湯分煎合并液（P＜0.05）。

表3 各組對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（x±s, n=10）

注：與生理鹽水組相比，**P＜0.01；*P＜0.05；與合煎組相比，#P＜0.05; ##P＜0.01

3.4 小鼠熱板試驗(yàn)結(jié)果

如表4所示，與生理鹽水組相比，單味藥材煎液灌胃均未能有效延長(zhǎng)小鼠的舔足潛伏期。三黃瀉心湯合煎液能顯著延長(zhǎng)30、60、90 min時(shí)小鼠的舔足潛伏期（P＜0.01），而三黃瀉心湯分煎合并液只能在30 min與90 min時(shí)延長(zhǎng)小鼠舔足潛伏期（P＜0.05）。因此可以認(rèn)為在延長(zhǎng)小鼠舔足潛伏期的作用上三黃瀉心湯合煎液要優(yōu)于三黃瀉心湯分煎合并液，亦優(yōu)于單味藥材煎液。

表4 各組對(duì)熱刺激致小鼠疼痛反應(yīng)的影響（x±s, n=10）

3.5 內(nèi)毒素致大鼠發(fā)熱試驗(yàn)結(jié)果

如表5所示，與生理鹽水組相比，三黃瀉心湯分煎合并液于給藥后2 h就顯示出顯著降低大鼠體溫的效果（P＜0.01），三黃瀉心湯合煎液（P＜0.01）與黃芩單煎液（P＜0.05）于給藥后3 h體現(xiàn)出了降低大鼠體溫的效果，給藥3 h后三黃瀉心湯合煎液為降溫效果最佳的一組（除陽(yáng)性組外）。各給藥組于給藥后4、5 h均能顯著性的降低內(nèi)毒素所致的大鼠發(fā)熱。

表5 各組對(duì)內(nèi)毒素致大鼠發(fā)熱的影響（x±s, n=10）

3.6 干酵母致大鼠發(fā)熱試驗(yàn)結(jié)果

如表6所示，與生理鹽水組相比，給藥1 h后各給藥組均能顯著性的降低大鼠體溫。給藥2 h后，隨著生理鹽水組大鼠體溫升高幅度減小，黃連單煎液組對(duì)大鼠體溫的降低作用不顯著。給藥3 h后，大黃單煎液對(duì)大鼠體溫的降低作用不顯著。三黃瀉心湯合煎液、三黃瀉心湯分煎合并液、黃芩單煎液于給藥后的1～6 h均顯示出顯著的降低大鼠體溫的藥理作用效果（P＜0.01），其對(duì)大鼠體溫降低幅度由高到低排序?yàn)椋汉霞逡海痉旨搴喜⒁海军S芩單煎液。

表6 各組對(duì)干酵母致大鼠發(fā)熱的影響（x±s, n=10）

4 總結(jié)與討論

通過試驗(yàn)對(duì)三黃瀉心湯處方藥材單煎液、分煎合并液、復(fù)方合煎液的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱效果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，在各項(xiàng)試驗(yàn)中分煎合并液的整體效果優(yōu)于藥材單煎液，說明三黃瀉心湯處方所含的三味藥材通過復(fù)方組合在發(fā)揮抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛藥理作用的過程中有協(xié)同增效的作用。同時(shí)，三黃瀉心湯復(fù)方合煎液的整體抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱藥效要優(yōu)于分煎合并液，證明三黃瀉心湯處方藥材通過合煎過程物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生了復(fù)雜的理化變化，其中一部分有效物質(zhì)以絮狀沉淀的形式存在，從而增強(qiáng)了該方藥效。由此可初窺三黃瀉心湯處方藥味組合有其道理，而傳統(tǒng)的三黃瀉心湯復(fù)方合煎制備工藝也有其科學(xué)內(nèi)涵。

在現(xiàn)代制劑的開發(fā)過程中，如何保證制劑開發(fā)的安全性、有效性、科學(xué)性一直是中醫(yī)經(jīng)典方劑開發(fā)的重點(diǎn)與難點(diǎn)。三黃瀉心湯作為經(jīng)方，在開發(fā)過程中是否要采取傳統(tǒng)經(jīng)典的復(fù)方合煎制備工藝一直存在疑問。本文僅從藥效學(xué)的角度證明了三黃瀉心湯處方藥材單煎液、分煎合并液、復(fù)方合煎液在抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用方面的差異，初步證明了三黃瀉心湯復(fù)方合煎的科學(xué)性，為三黃瀉心湯在現(xiàn)代開發(fā)中提取工藝的確定提供了參考。而各組煎液的藥效學(xué)差異必定是由其物質(zhì)基礎(chǔ)所決定的，還有待于對(duì)單味藥單煎液、單煎合并液、復(fù)方合煎液進(jìn)行化學(xué)成分的研究，找出化學(xué)成分變化與藥效作用變化之前的關(guān)聯(lián)性，以更全面地為三黃瀉心湯的工藝研究、成藥開發(fā)、臨床使用提供科學(xué)理論基礎(chǔ)。

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