干擾小RNA沉默CAV 1表達對人絨毛膜癌JEG- 3細胞侵襲、遷移能力的影響及其作用機制研究

陳靜鴿，周斌，王川紅，程玉敏，周新華，李新敏，王陳英，喬文菲

鄭州市婦幼保健院1住院部，2病理科，3檢驗科，鄭州450000

4新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學系，河南 新鄉(xiāng)453000

妊娠性滋養(yǎng)細胞腫瘤在中國的發(fā)病率較高，是一種發(fā)生于胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞的惡性腫瘤，其中以絨毛膜癌最為常見[1]。正常滋養(yǎng)細胞具有侵入血管和組織的能力，當該類細胞發(fā)生病變成為腫瘤時，則具有更強的浸潤、破壞和轉(zhuǎn)移能力[2]。近年來，隨著現(xiàn)代技術的進步，絨毛膜癌的病死率明顯降低，采用有效的化療藥物治療是其常用的治療方法。但由于絨毛膜癌細胞具有較強的侵襲能力，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，故預后極差[3]。因此，研究如何抑制絨毛膜癌細胞的侵襲和遷移能力成為臨床上迫切需要解決的問題。小窩蛋白-1（caveolin-1，CAV1）是一種細胞支架蛋白，參與細胞的增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導、侵襲、遷移等過程[4]。近年來的報道表明，CAV1對多種腫瘤如甲狀腺癌[5]、食管癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[7]等的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，但CAV1在絨毛膜癌中的作用尚不完全清楚，因此本文通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術下調(diào)人絨毛膜癌JEG-3細胞中CAV1的相對表達量，旨在探究其對人絨毛膜癌JEG-3細胞侵襲、遷移能力的影響及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人絨毛膜癌細胞系JEG-3購自中國科學院動物研究所，培養(yǎng)基（RPMⅠ-1640）、胰蛋白酶均購自美國Hyclon公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，青霉素、鏈霉素均購自河北省華北制藥有限公司，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Ⅰnvitrogen公司，Transwell侵襲、遷移小室購自美國Corning Costar公司，化學合成干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）購自上海吉瑪公司，CAV1抗體購自美國Santa Cruz公司，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）抗體、雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）抗體、p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）抗體、磷酸化 AKT（p-AKT）抗體、磷酸化MTOR（p-MTOR）抗體、磷酸化p70S6K（p-p70S6K）抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自北京中杉金橋技術有限公司，HRP標記山羊抗兔ⅠgG購自武漢博士德公司。微量加樣槍購自德國Eppendorf公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，酶標儀購自美國Bio-Tek公司，細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將JEG-3細胞凍存管置于37℃水浴箱中快速溶化，1500 r/min離心5 min，加入5 ml培養(yǎng)基重懸細胞，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達到80%左右，棄去培養(yǎng)基，加入0.25%胰酶消化細胞，按1∶3的比例進行傳代，每隔2 d傳代一次。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染0.25%胰酶消化對數(shù)生長期JEG-3細胞，以2×105/孔細胞接種于6孔板上，培養(yǎng)于37℃培養(yǎng)箱中，待細胞融合度達到80%左右進行轉(zhuǎn)染。實驗共分為3組：對照組，只加入LipofectamineTM2000，不進行轉(zhuǎn)染；陰性組：轉(zhuǎn)染siRNA-NC；siRNA-CAV1組：轉(zhuǎn)染siRNA-CAV1。將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。將4 μg siRNA-NC及 4 μg siRNA-CAV1 分別加至 250 μl無血清培養(yǎng)基中進行稀釋，將5 μl LipofectamineTM2000加至50 μl無血清培養(yǎng)基中進行稀釋，將稀釋后的混合物輕輕混勻，37℃靜置20 min，形成siRNA-CAV1-LipofectamineTM2000復合物，將復合物加入6孔板中，培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細胞。蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 實時定量PCR 采用實時定量PCR（qRTPCR）檢測轉(zhuǎn)染細胞中CAV1mRNA的水平。利用Primer 5.0軟件設計CAV1基因的引物序列，上游序列為5'-ATGTCTGGGGGCAAATAC-3'，下游序列為5'-TTATATTTCTTTCTGCAAGTTG-3'，由上海生物工程技術有限公司進行合成，轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，加入1 ml TRⅠzon細胞裂解液提取2×107個細胞中的總RNA，去除基因組DNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以GAPDH為參照，進行擴增。反應體系為25 μl，擴增條件為94℃10 min預變性，94℃ 10 s，58 ℃/60℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算CAV1mRNA的表達水平。實驗重復3次。

1.2.4 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法檢測JEG-3細胞侵襲能力。0.25%胰酶消化對數(shù)生長期JEG-3細胞，加入無血清培養(yǎng)基調(diào)整Matrigel膠濃度為 1.7 μg/μl，將稀釋好的 Matrigel膠均勻鋪在Transwell小室上室膜中，37℃通風4～5 h，備用。以每孔4×104個細胞接種于小室上室中，下室中加入600 μl新鮮的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，Transwell小室置于24孔板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，采用無菌棉簽輕輕擦去小室膜上的細胞，4%的多聚甲醛固定30 min，蘇木精染色40 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后置于倒置顯微鏡中觀察，隨機選取5個視野，取平均值，每孔3個復孔。

1.2.5 細胞遷移能力檢測 采用Transwell法檢測細胞遷移能力。實驗方法同“1.2.4”，但在接種細胞前無需在Transwell小室上室中鋪Matrigel膠。倒置顯微鏡下計算遷移細胞數(shù)目。

1.2.6 Western blot檢測AKT/MTOR/p70 S 6 K信號通路蛋白的表達 加入2 ml PBS漂洗細胞2次，離心收集細胞，加入一定體積的RⅠPA細胞裂解液，在冰上裂解30 min，收集上清（上清即為所提取的總蛋白）。采用BAC法進行蛋白質(zhì)定量。將蛋白質(zhì)樣品按4∶1的比例加入5×上樣緩沖液，置于100℃中加熱10 min。配置8%的分離膠，每孔加入40 μg樣品蛋白，80 V電泳直至蛋白質(zhì)條帶完全分離。切下目的蛋白凝膠，在300 mA電流下將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，內(nèi)參β-actin的轉(zhuǎn)膜時間為70 min，其他蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜時間為180 min。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜浸潤在5%脫脂牛奶中封閉1 h。加入各蛋白質(zhì)一抗，4℃下過夜結(jié)合，TBST清洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育60 min，TBST清洗3次后加入化學發(fā)光劑，暗室中曝光至條帶明顯，以β-actin為內(nèi)參，Quantity One分析 CAV1、AKT、MTOR、p70S6K、p-AKT、p-MTOR、p-p70S6K蛋白質(zhì)的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟-件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CAV 1 mRNA和蛋白相對表達量的比較

采用qRT-PCR和Western blot法分別檢測轉(zhuǎn)染后JEG-3細胞中CAV1mRNA和蛋白的相對表達量，結(jié)果顯示：siRNA-CAV1組、陰性組、對照組JEG-3細胞中CAV1mRNA和蛋白的相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；siRNA-CAV1組JEG-3細胞中CAV1蛋白和mRNA的相對表達量均較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；陰性組JEG-3細胞中CAV1蛋白和mRNA的相對表達量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同組別JEG- 3細胞中CAV 1 mRNA及蛋白相對表達量的比較（ n= 3，±s）

表1 不同組別JEG- 3細胞中CAV 1 mRNA及蛋白相對表達量的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組陰性組siRNA-CAV1組F值P值1.528±0.240 1.612±0.235 0.723±0.085*18.06 0.003 0.562±0.087 0.533±0.069 0.147±0.023*37.57 0.000 CAV1 mRNA CAV1蛋白

2.2 干預CAV 1表達對細胞侵襲能力的影響

siRNA-CAV1組、陰性組、對照組JEG-3細胞的侵襲數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與對照組相比，siRNA-CAV1組JEG-3細胞的侵襲數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；陰性組與對照組JEG-3細胞的侵襲數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 干預CAV 1表達對細胞遷移能力的影響

siRNA-CAV1組、陰性組、對照組JEG-3細胞的遷移數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與對照組相比，siRNA-CAV1組JEG-3細胞的遷移數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；陰性組與對照組JEG-3細胞的遷移細胞數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）

表2 不同組別JEG- 3細胞侵襲數(shù)目的比較（ n= 3，±s）

表2 不同組別JEG- 3細胞侵襲數(shù)目的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組陰性組siRNA-CAV1組F值P值236.67±28.64 241.37±25.77 123.49±23.86*19.53 0.002侵襲數(shù)目

表3 不同組別JEG- 3細胞遷移數(shù)目的比較（ n= 3，±s）

表3 不同組別JEG- 3細胞遷移數(shù)目的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組陰性組siRNA-CAV1組F值P值135.27±23.67 142.60±28.64 63.86±7.21*11.89 0.008遷移數(shù)目

2.4 干預CAV 1表達對AKT/MTOR/p70S6K信號通路蛋白的影響

siRNA-CAV1組、陰性組、對照組JEG-3細胞中AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；siRNA-CAV1組JEG-3細胞中AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的表達水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；陰性組與對照組JEG-3細胞中AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR、p70S6K、p-p70S6K蛋白的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表4）

3 討論

既往研究表明，絨毛膜癌細胞的侵襲、遷移過程受多種因素的影響，是一個復雜的過程[8]。絨毛膜癌是一種惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。絨毛膜癌細胞具有較高的侵襲和遷移能力，在絨毛膜癌早期可以通過血液運輸轉(zhuǎn)移至全身，嚴重影響絨毛膜癌的治療效果，其中腦轉(zhuǎn)移最為常見，也是絨毛膜癌病死率較高的原因之一。因此，研究基因在絨毛膜癌侵襲、遷移中的作用機制，為絨毛膜癌的基因治療提供新的思路已成為目前研究的熱點之一。RNAi技術是通過化學合成、體外轉(zhuǎn)錄、降解核酸內(nèi)切酶等方式特異性沉默靶基因的技術，具有瞬時轉(zhuǎn)染沉默的效應，目前RNAi技術已成為研究基因功能的有效工具。CAV1是一種細胞膜中重要的支架蛋白，分子量為21～24 kD，對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、脂類代謝、細胞生長及細胞的侵襲和遷移等方面具有重要意義[9]。相關研究表明，CAV1參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，比如肺癌、乳腺癌及前列腺癌[10-12]。近年來的研究表明，CAV1既可以作為一個抑癌因子參與腫瘤的演進過程，又可以作為一個原癌基因促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。相關研究證實，乳腺癌中CAV1的表達水平與腫瘤細胞的增殖、自噬以及患者預后有關[14]。為了探究CAV1在絨毛膜癌細胞侵襲、遷移中的作用，本研究通過siRNA介導的RNAi技術干擾CAV1在絨毛膜癌JEG-3細胞中的表達，研究其對細胞侵襲、遷移能力的影響，結(jié)果顯示下調(diào)絨毛膜癌中CAV1的表達水平可以抑制細胞的侵襲和遷移能力。

表4 不同組別JEG- 3細胞AKT/MTOR/p70 S 6 K信號通路相關蛋白表達水平的比較（ n= 3，±s）

表4 不同組別JEG- 3細胞AKT/MTOR/p70 S 6 K信號通路相關蛋白表達水平的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組陰性組siRNA-CAV1組F值P值0.657±0.074 0.662±0.085 0.343±0.026*22.47 0.002 0.683±0.084 0.674±0.061 0.387±0.046*19.79 0.002 0.587±0.067 0.592±0.034 0.286±0.033*41.04 0.000 0.752±0.083 0.783±0.075 0.412±0.055*24.54 0.001 0.812±0.073 0.823±0.079 0.352±0.052*45.56 0.000 0.863±0.091 0.871±0.086 0.423±0.053*32.00 0.001 AKT p-AKT MTOR p-MTOR p70S6K p-p70S6K

AKT介導的信號通路與細胞的增殖、分化、侵襲關系較為密切，可調(diào)控腫瘤細胞周期蛋白和細胞蛋白的合成，對腫瘤的血管生成具有重要作用[15]。該通路的激活可以促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進細胞有絲分裂的進行，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[16]。AKT主要通過N端的PH結(jié)構(gòu)域與3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇結(jié)合，同時通過磷脂酰依賴性激酶激活絲氨酸和蘇氨酸而被活化，從而激活下游靶基因MTOR，進而介導下游重要的信號轉(zhuǎn)導因子p70S6K磷酸化，最終調(diào)控腫瘤細胞的生長、分化、周期、侵襲等[17]。MTOR參與細胞的有絲分裂進程，主要調(diào)控G1期和S期蛋白的合成，MTOR磷酸化被抑制可阻滯細胞周期，從而誘導細胞凋亡[18]。p70S6K是MTOR信號通路下游的一個重要的靶基因，可被MTOR激活形成p-p70S6K，調(diào)控核糖體蛋白的合成和mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯，促進腫瘤細胞的分化、增殖[19]。大量的研究表明，多種基因表達量的變化均可通過調(diào)控AKT/MTOR信號通路參與乳腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤細胞的生長、分化、侵襲、凋亡[20]。研究表明，MTOR信號通路阻斷藥雷帕霉素可以抑制絨毛膜癌細胞的增殖，誘導其凋亡，降低細胞的侵襲能力[21]。目前關于AKT/MTOR信號通路對絨毛膜癌細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡的研究不多，本實驗通過Western blot檢測經(jīng)siRNA特異性干擾CAV1表達的絨毛膜癌細胞中AKT、MTOR、p70S6K以及磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，AKT、MTOR、p70S6K、p-AKT、p-MTOR、p-p70S6K的表達量明顯降低，表明干擾CAV1對絨毛膜癌細胞侵襲、遷移能力的抑制作用與AKT/MTOR/p70S6K信號通路有關。

綜上所述，RNAi技術下調(diào)絨毛膜癌JEG-3細胞中CAV1的表達水平可抑制細胞的侵襲及遷移能力，誘導細胞凋亡，其作用機制與AKT/MTOR/p70S6K信號通路有關，為絨毛膜癌的基因治療提供了新的靶點。

[1]Stichelbout M,Devisme L,Franquet-Ansart H,et al.SALL4 expression in gestational trophoblastic tumors:a useful tool to distinguish choriocarcinoma from placental site trophoblastic tumor and epithelioid trophoblastic tumor[J].Hum Pathol,2016,54:121-126.

[2]Liu S,Fan C,Feng F,et al.Prognosis of gestational choriocarcinoma diagnosed incidentally during laparoscopy for a presumed cornual pregnancy:a report of five cases[J].Cancer Biol Med,2017,14(2):191-193.

[3]Sekiya Y,Yamamoto E,Niimi K,et al.c-rel promotes invasion of choriocarcinoma cells via PⅠ3K/AKT signaling[J].Oncology,2017,92(5):299-310.

[4]袁碧英,易斌,魯開智.Caveolin-1在腫瘤中的作用機制的研究進展[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2014,11(6):129-131.

[5]趙樂,唐萃,楊磊,等.Caveolin-1、GPR30和Vimentin在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及意義[J].中國免疫學雜志,2015,31(11):1510-1514.

[6]范玉宏,周海豐,侯占富,等.Caveolin-1和β-catenin在食管鱗癌中的表達及臨床意義[J].山西醫(yī)科大學學報,2017,48(7):706-710.

[7]韓燕燕,朱俊寶,李淑華.Caveolin-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及臨床意義[J].中國癌癥防治雜志,2017,9(3):201-204.

[8]Wang Y,Xue K,Guan Y,et al.Long non-coding RNA LⅠNC00261 suppresses cell proliferation and invasion and promotes cell apoptosis in human choriocarcinoma[J].Oncol Res,2017,25(5):733-741.

[9]Mi L,Zhu F,Yang X,et al.The metastatic suppressor NDRG1 inhibits EMT,migration and invasion through interaction and promotion of caveolin-1 ubiquitylation in human colorectal cancer cells[J].Oncogene,2017,36(30):4323-4335.

[10]Caiola E,Marrazzo E,Alesci S,et al.ΔNp73beta induces caveolin-1 in human non-small cell lung cancer cell line H1299[J].Tumor Biol,2016,37(2):2015-2021.

[11]Joglekar M,Elbazanti WO,Weitzman MD,et al.Caveolin-1 mediates inflammatory breast cancer cell invasion via the Akt1 pathway and RhoC GTPase[J].J Cell Biochem,2017,118(5):1273.

[12]Mahmood J,Murti SC,Zaveri SR,et al.Caveolin-1:a novel prognostic biomarker for radioresistance in non-small cell lung carcinoma(NSCLC)and prostate cancer[J].Ⅰnt J Radiat Oncol Biol Phys,2016,96(2):E589-E590.

[13]李慶偉,周瑩,逄越.Caveolin-1結(jié)構(gòu)、功能及其與腫瘤的關系[J].遼寧師范大學學報(自然科學版),2017,40(2):232-238.

[14]石小玉,肖亮,熊麗霞,等.Caveolin-1 siRNA對與乳腺癌細胞共培養(yǎng)的成纖維細胞自噬體表達影響的研究[J].中國細胞生物學學報,2015,37(2):212-220.

[15]Wang Z,Li Y,Banerjee S,et al.Down-regulation of notch-1 and jagged-1 inhibits prostate cancer cell growth,migration and invasion,and induces apoptosis via inactivation of Akt,mTOR,and NF-B signaling pathways(retraction of vol 109,pg 726,2010)[J].J Cell Biochem,2016,117(8):1960.

[16]Qian B,Yao Y,Liu C,et al.SU6668 modulates prostate cancer progression by downregulating MTDH/AKT signaling pathway[J].Ⅰnt J Oncol,2017,50(5):1601-1611.

[17]Liang Q,Luo Z,Zeng J,et al.Zika virus NS4A and NS4B proteins deregulate Akt-mTOR signaling in human fetal neural stem cells to inhibit neurogenesis and induce autophagy[J].Cell Stem Cell,2016,19(5):663-671.

[18]Allen E,Miéville P,Warren CM,et al.Metabolic symbiosis enables adaptive resistance to anti-angiogenic therapy that is dependent on mTOR signaling[J].Cell Rep,2016,15(6):1144-1160.

[19]Renard J,Loureiro M,Rosen LG,et al.Cannabidiol counteracts amphetamine-induced neuronal and behavioral sensitization of the mesolimbic dopamine pathway through a novel mTOR/p70S6 kinase signaling pathway[J].J Neurosci,2016,36(18):5160-5169.

[20]Yip PY.Phosphatidylinositol 3-kinase-AKT-mammalian target of rapamycin(PⅠ3K-Akt-mTOR)signaling pathway in non-small cell lung cancer[J].Transl Lung Cancer Res,2015,4(2):165-176.

[21]Zhang Y,Hu X,Gao G,et al.Autophagy protects against oxidized low density lipoprotein-mediated inflammation associated with preeclampsia[J].Placenta,2016,48:136-143.