古田紅曲米抗氧化活性物質(zhì)的分離純化

張紅林，李桂玲,2，蘇國(guó)成，劉靜雯,2，李健,3

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021）（2.廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361021）（3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021）

紅曲又稱丹曲，是由紅曲霉接種到大米發(fā)酵而來的一種紫紅色米曲，是一種藥食兩用的傳統(tǒng)食品。明代《天工開物》中記載：紅曲具有殺菌和抑菌作用，在魚肉上涂紅曲可以延緩它的變質(zhì)[1]。雖然古代有此記錄，但近現(xiàn)代對(duì)紅曲的研究較少。1979年，日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章[2]首次從紅曲中分離到一種可抑制人體膽固醇合成的活性物質(zhì)，命名為 Monacolin K，才由此掀起國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紅曲的廣泛關(guān)注。Lee等[3]研究了紅曲發(fā)酵產(chǎn)生的色素Monascin和Ankaflavin，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)提高學(xué)習(xí)和記憶能力以及延緩衰老有很好的功效。溫學(xué)偉等[4]通過對(duì)紅曲的抗氧化研究得出：紅曲中含有許多如色素、酚類、Dimerumic acid、他汀類等不同的抗氧化物質(zhì)，它們的存在可以消除氧自由基的傷害，保護(hù)人體健康。Liu等[5]以分離純化到的紅曲色素Ankascin 568 plus喂食小鼠4個(gè)月，結(jié)果表明：4個(gè)月后總膽固醇下降與低密度脂蛋白均有所下降。李明起等[6]以柱層析分離純化功能性紅曲米中的有效成分，得到了紅曲黃色素，洛伐他汀粗品，醇溶性紅曲紅色素，水溶性紅曲紅色素4種組分。

現(xiàn)代研究表明，紅曲中除含有洛伐他汀和紅曲色素外，還有脂肪酸、甾醇、生物堿和黃酮等多種活性物質(zhì)，具有降血壓、降血脂、降血糖以及抗腫瘤等藥理作用[7]。紅曲的功效眾多，成分復(fù)雜，但近年來，對(duì)紅曲的研究主要集中在紅曲色素及其功效，紅曲菌株篩選以及發(fā)酵等方面的研究，對(duì)其進(jìn)行脂溶性活性物質(zhì)的分離純化研究報(bào)道較少，因此對(duì)紅曲進(jìn)行活性物質(zhì)的分離純化研究就有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本文以不同產(chǎn)地紅曲及不同有機(jī)溶劑紅曲提取物為材料，對(duì)其進(jìn)行抑菌，抗氧化活性的測(cè)定，并以此結(jié)果為依據(jù)，選擇抑菌活性較好的古田紅曲為材料，進(jìn)一步對(duì)甲醇提取物進(jìn)行活性物質(zhì)的分離純化，采用 Sephadex LH-20凝膠柱層析、制備型反相中壓色譜柱層析、正相硅膠柱層析等分離純化方法，結(jié)合薄層層析（TLC），紫外吸收光譜（UV）、核磁共振波譜（NMR）以及質(zhì)譜（MS）等技術(shù)，對(duì)其進(jìn)行分析追蹤和結(jié)構(gòu)鑒定，最終分離出亞油酸和α-亞麻酸兩個(gè)活性化合物。亞油酸能抑制腸道病原菌，具有防癌，抗氧化作用，其參與人體心血管疾病的控制，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[8]。α-亞麻酸也在抗氧化，調(diào)節(jié)血脂，降低血糖血壓，預(yù)防心血管疾病，抑制癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移方面具有很好的生理活性[9]，此2種物質(zhì)為紅曲相關(guān)食療和藥用的研究提供了理論基礎(chǔ)和一定的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

古田紅曲米，福建古田平湖鎮(zhèn)玉源村；梅州紅曲米，廣東梅州市客家紅曲生物制品有限公司；麗水紅曲米，浙江麗水力克生物科技有限公司；上饒紅曲米，江西省諾博生物科技有限公司；釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉和塔賓曲霉，菌株由集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供；牛津杯（Φ8 mm），東臺(tái)市吉泰制品廠；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、分析純，西隴化工股份有限公司；乙醇、石油醚、分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司；DPPH、標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；技術(shù)瓊脂粉、酵母浸膏，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氘代氯仿、色譜純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-3型循環(huán)水多用型真空泵，鄭州杜甫儀器廠；DBS-100型全自動(dòng)部分收集器，上海青浦滬西儀器廠；ZF型紫外分析儀，上?？等A生儀器制造廠；Lambda 265型紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)珀金埃爾默公司；AVANCE 400 MHz型核磁共振儀，Bruker公司；P0100型制備型中壓反相色譜儀，北京慧德易科技有限公司；Varian 300型液質(zhì)聯(lián)用儀，瓦里安公司；Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠，GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定樣品的制備

將購(gòu)買的古田、梅州、麗水，上饒4個(gè)地區(qū)的紅曲米以粉碎機(jī)高速粉碎，過100目篩，然后各稱取50 g置于300 mL錐形瓶，以甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚5種有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，萃取條件：料液比1:3，溫度30 ℃，超聲時(shí)間2 h，超聲功率100 Hz，萃取3次，將提取液合并，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，分別配制2、5、10、20、40、80、160、320 mg/mL母液備用。

另外稱取50 g和1000 g古田地區(qū)紅曲米以同樣提取條件進(jìn)行提取。50 g的一份將提取物以100%水-甲醇、75%水-甲醇、50%水-甲醇、25%水-甲醇、100%甲醇共5個(gè)梯度進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度洗1 L，將洗脫液濃縮蒸干，配制2 mg/mL的樣品液備用。1000 g的一份則經(jīng)過抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成甲醇粗提物的浸膏。

1.3.2 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

按照Huang等[10]的方法稍作改動(dòng)，在無菌條件下，將經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的固體培養(yǎng)基（釀酒酵母，黑曲霉和塔賓曲霉用 YPD培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌用LB培養(yǎng)基）冷卻至溫度在40 ℃～45 ℃之間，加入一定量的未經(jīng)稀釋菌懸液，使菌濃度為(1.0～5.0)×104CFU/mL，搖勻后均勻倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用經(jīng)滅菌的鑷子夾取經(jīng)滅菌的牛津杯擺放于其中，用移液槍吸取200 μL各供試化合物加入牛津杯內(nèi)，同時(shí)做試劑空白和陽(yáng)性對(duì)照。釀酒酵母陽(yáng)性對(duì)照用兩性霉素B，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌用氯霉素，待溶劑擴(kuò)散后，取下牛津杯，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算3次測(cè)量的平均值。

1.3.3 DPPH法測(cè)定抗氧化能力

參照曾嵐等[11]的方法并做稍微的改動(dòng)進(jìn)行測(cè)定。將2 mg/mL不同有機(jī)溶劑萃取古田紅曲米粗提物、不同地區(qū)紅曲米粗提物以及不同梯度甲醇-水洗脫液 0.1 mL分別加入2 mL 6.25×10-5mol/L DPPH甲醇溶液中，混勻暗處放置30 min，以甲醇溶液做空白對(duì)照，測(cè)量其在517 nm處的吸光度（Ai）。同時(shí)，測(cè)定2 mL DPPH甲醇溶液與0.1 mL甲醇混合液在517 nm處的吸光度（A0）；測(cè)定2 mL甲醇溶液與0.1 mL樣品液在517 nm處的吸光度（Aj）。按照以下公式(1)計(jì)算自由基清除率

1.3.4 化合物的分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.4.1 化合物的分離純化

將古田地區(qū)甲醇萃取物浸膏以少量硅膠粉（200～300目）拌樣，拌至呈肉松狀松散。上預(yù)先處理好的制備型中壓液相（反相C18硅膠柱）色譜，水（H）和甲醇(M)用不同比例配成混合物，分別是100%H；75%H-25%M；50%H-50%M；25%H-75%M；100%M，形成不同極性的洗脫溶劑對(duì)樣品進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，以TLC進(jìn)行分析，用紫外分析儀、碘顯色、5%硫酸-95%乙醇、碘化鉍鉀分別顯色，比較不同顯色方法的情況差異，合并相似的組分，尋找目標(biāo)點(diǎn)進(jìn)行下一步的分離純化。

將合并后的目標(biāo)組分以 Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)行純化，經(jīng)過中壓液相和LH-20凝膠柱層析多次分離純化，得到相對(duì)比較純的單一目標(biāo)組分，最后以正相硅膠柱層析進(jìn)行除雜，得到純化后的化合物。

1.3.4.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

（1）核磁共振分析（NMR）

將純化后得到的化合物A和B經(jīng)過旋蒸濃縮后轉(zhuǎn)移至核磁管中，真空減壓蒸發(fā)蒸干溶劑，加入氘代氯仿，以TMS作為內(nèi)標(biāo)，通過400 MHz核磁共振儀測(cè)定化合物的核磁譜。測(cè)定的項(xiàng)目包括：1H-NMR，13C-NMR。

（2）電噴霧質(zhì)譜分析（ESI-MS）

將純化得到的化合物A和B蒸干，取微量以25%氯仿-甲醇溶液溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜后測(cè)定質(zhì)譜。電離源為電噴霧電離源，采用負(fù)離子及正離子相切換的模式測(cè)定。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

紅曲粗提物抑菌、抗氧化實(shí)驗(yàn)部分所有測(cè)定數(shù)據(jù)均做 3個(gè)平行，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。其中不同產(chǎn)地紅曲米甲醇萃取物對(duì)細(xì)菌抑菌能力的比較及不同有機(jī)溶劑的古田紅曲米萃取物抑菌能力的比較這兩部分以 SPSS 17.0軟件分析并處理數(shù)據(jù)，以p＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；其它部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Origin 9.1軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

2.1.1 不同產(chǎn)地紅曲米甲醇萃取物對(duì)細(xì)菌抑菌能力的比較

將福建及其周邊地區(qū)的紅曲米各取一份，對(duì)其進(jìn)行甲醇提取做枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，以SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 不同產(chǎn)地紅曲米甲醇提取物對(duì)細(xì)菌的抑菌作用Table 1 Bacteriostatic effects of methanol extracts of red yeast rice on bacteria from different regions

從表1分析我們得出，同一地區(qū)紅曲提取物對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果有差異，其中，紅曲提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果要略高于大腸桿菌；不同產(chǎn)地的紅曲米甲醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果也不相同，古田和麗水紅曲提取物之間對(duì)這兩種菌株的抑菌效果差異不顯著（p＞0.05），但是它們對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌效果要好于梅州和上饒紅曲米提取物，且古田紅曲米相對(duì)于其它3個(gè)地區(qū)，其對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌作用更好。趙樹新等[12]人報(bào)道，紅曲具有抑菌作用主要是具有多種抑菌活性物質(zhì)，包括紅曲色素、Monascidin A、安卡內(nèi)酯、幾丁質(zhì)酶、桔霉素和糖肽類物質(zhì)等。本研究得出的紅曲提取物具有抑菌作用，可能是由于紅曲提取物中的紅曲色素及其它活性物質(zhì)的存在導(dǎo)致的。

2.1.2 古田紅曲米甲醇提取物對(duì)不同菌種的抑菌活性

配制系列梯度的古田紅曲米甲醇提取物樣品溶液，對(duì)它做細(xì)菌和釀酒酵母的抑菌實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以O(shè)rigin 9.1進(jìn)行處理，結(jié)果如下圖1所示。

從圖1可以看出，隨著紅曲米提取物濃度的逐漸增大，對(duì)某一菌種而言，其抑菌圈直徑呈逐漸增大的趨勢(shì)。同一濃度的紅曲米提取物對(duì)不同菌種的抑菌效果也不相同，其中抑菌效果從大到小為枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞釀酒酵母菌。因?yàn)榕＝虮睆綖? mm，因此我們認(rèn)為，如果抑菌圈直徑小于8 mm則無明顯的抑菌效果。從圖中可以看出，當(dāng)甲醇提取物濃度為20 mg/mL時(shí)，紅曲米提取物對(duì)釀酒酵母菌無明顯作用。

此外，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以推斷出，不同菌種對(duì)同一濃度的樣品敏感性不同，枯草芽孢桿菌敏感性微大于大腸桿菌，細(xì)菌的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于釀酒酵母菌。

圖1 不同濃度古田紅曲米甲醇提取物對(duì)細(xì)菌和釀酒酵母的抑菌作用Fig.1 Bacteriostatic effects of methanol extracts of different concentrations of Gutian red yeast rice on bacteria and saccharomyces cerevisiae

2.1.3 不同有機(jī)溶劑的古田紅曲米萃取物抑菌能力的比較

選取80 mg/mL以不同有機(jī)溶劑萃取的古田紅曲米提取物為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其做大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母，黑曲霉和塔賓曲霉的抑菌實(shí)驗(yàn)，以SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

從表2可以得出，同一濃度乙酸乙酯和丙酮提取物對(duì)相同菌株的抑菌活性差異不顯著（p＞0.05），且這兩種提取物對(duì)各供試菌株均有很好的抑菌效果。甲醇和乙醇提取物之間的抑菌活性除了黑曲霉差異顯著外（p＜0.05），其余的差異不顯著（p＞0.05）；石油醚提取物與其余提取物相比，同一菌株抑菌方面，均表現(xiàn)為差異顯著（p＜0.05）。對(duì)同一溶劑提取物而言，除丙酮和乙酸乙酯提取物對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果差異不顯著外，甲醇、乙醇和石油醚的提取物對(duì)這兩種細(xì)菌均表現(xiàn)為差異顯著；在對(duì)黑曲霉和塔賓曲霉的抑菌實(shí)驗(yàn)中，除乙醇提取物對(duì)這兩種霉菌抑菌顯著外，其余有機(jī)溶劑提取物抑菌效果均表現(xiàn)為不顯著（p＞0.05）；此外，同一有機(jī)溶劑提取物中，釀酒酵母菌和其它菌種的抑菌活性基本上表現(xiàn)為差異顯著（p＜0.05）。

總的來說，不同有機(jī)溶劑萃取出的古田紅曲米提取物對(duì)同一菌種的抑菌活性并不相同，對(duì)不同菌種的抑菌活性差異也很大。其中同一溶劑，同一濃度的提取物對(duì)不同菌種的抑菌活性從大到小基本分為：枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞黑曲霉＞塔賓曲霉＞釀酒酵母，大致可分布為：細(xì)菌＞霉菌＞酵母菌。此外，我們也可以發(fā)現(xiàn)，隨著提取溶劑極性的較低，相應(yīng)提取物抑菌活性大致呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，其中丙酮和乙酸乙酯提取物抑菌活性相對(duì)較高，甲醇和乙醇次之，石油醚提取物抑菌活性最弱，其原因可能是由不同微生物細(xì)胞類型不同以及其對(duì)抑菌活性物質(zhì)的敏感度差異造成的[13]。

表2 古田紅曲米不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)不同菌種的抑菌作用Table 2 Bacteriostatic effects of different organic solvent extracts of red yeast rice on different strains

2.2 DPPH法測(cè)定抗氧化能力

2.2.1 不同產(chǎn)地紅曲米甲醇提取物清除 DPPH自由基的能力

將甲醇提取古田紅曲米粗提物與甲醇提取梅州、麗水、新余紅曲米粗提物進(jìn)行清除DPPH自由基能力的測(cè)定，其結(jié)果如圖2。

圖2 古田與其它地區(qū)紅曲米提取物清除DPPH自由基的能力Fig.2 Ability of the extracts of red yeast rice from Gutian and other regions to scavenge DPPH free radicals

由圖 2可知，不同地區(qū)紅曲米甲醇提取物清除DPPH自由基的能力有顯著差異。其中古田紅曲米甲醇提取物清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，麗水紅曲米次之，但是和甲醇提取物抗氧化能力相近。古田和麗水紅曲米抗氧化能力明顯高于上饒和梅州紅曲米，出現(xiàn)這種原因的情況可能是與地域環(huán)境有關(guān)，不同地域產(chǎn)生的紅曲其抗氧化成分也不盡相同。林風(fēng)[14]曾經(jīng)研究過，國(guó)內(nèi)紅曲主要起源于古田地區(qū)，悠久的紅曲菌種歷史環(huán)境可能導(dǎo)致了它的獨(dú)特菌種及相對(duì)高抗氧化性。

2.2.2 不同有機(jī)溶劑萃取古田紅曲米提取物清除DPPH自由基的能力

圖3 不同有機(jī)溶劑萃取古田紅曲米提取物清除DPPH自由基的能力Fig.3 Ability of different organic solvent extracts of Gutian red yeast rice to scavenge DPPH free radicals

將甲醇提取古田紅曲米粗提物與乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚提取古田紅曲米粗提物進(jìn)行清除DPPH自由基能力的測(cè)定，其結(jié)果如圖3。

由圖3可知，不同有機(jī)溶劑萃取古田紅曲米粗提物其清除DPPH自由基的能力存在差異，按照由大到小的順序排列為：乙酸乙酯＞甲醇＞丙酮＞乙醇＞石油醚。甲醇提取物清除DPPH自由基的能力除了比乙酸乙酯提取物清除DPPH能力略低外，都顯著高于其它有機(jī)溶劑提取物。甲醇提取物比乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基能力低的原因推測(cè)可能和它的極性有關(guān)，由于甲醇極性較大，萃取出一些非活性物質(zhì)雜質(zhì)，導(dǎo)致其有效成分相對(duì)降低。

2.2.3 古田紅曲米甲醇梯度洗脫液清除 DPPH自由基的能力

將2 mg/mL古田紅曲米甲醇萃取物不同梯度洗脫液進(jìn)行清除DPPH自由基的測(cè)定，結(jié)果如圖4。

圖4 古田紅曲米水-甲醇梯度洗脫液清除DPPH自由基的能力Fig.4 Ability of gradient eluent by water and methanol from Gutian red yeast rice to scavenge DPPH free radicals

由圖4可知，不同梯度洗脫液其抗氧化活性也不一樣。隨著甲醇比例的加大，其抗氧化能力在逐漸的升高，在75%M時(shí)達(dá)到最大值，然后隨著甲醇比例繼續(xù)增大，其清除DPPH自由基的能力開始下降。不同梯度洗脫液清除DPPH自由基能力從大到小依次排列為：75%M＞50%M＞100%M＞25%M＞0%M。說明與水相比，相對(duì)極性小一點(diǎn)的甲醇洗脫液其清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)。因此，選擇實(shí)驗(yàn)樣品時(shí)，最好挑選50%M～100%M洗脫液部分進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 化合物A的結(jié)構(gòu)鑒定

用氘代氯仿溶解化合物A，得出的NMR數(shù)據(jù)如表3所示?；衔顰的氫譜中有8種質(zhì)子信號(hào)，δ10.24為羧基的氫信號(hào)，δ5.37為雙鍵的氫信號(hào)，δ2.80(2H, m)為處于兩個(gè)雙鍵之間的-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ2.07(2H, m)為-CH2-CH=CH-中-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ1.66(2H, m)為飽和脂肪酸上的-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ1.33(12H, m)為C-8～C-13上的-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ0.91為末端甲基氫信號(hào)。

化合物A的碳譜中有17個(gè)碳信號(hào)，其中δ130.24、δ130.04、δ128.08、δ127.91可推測(cè)為共軛雙鍵的碳信號(hào)，δ33.70為-CH2-COOH中-CH2-信號(hào)，δ14.08為末端-CH3碳信號(hào)，其它信號(hào)可推測(cè)為甲基或者亞甲基的碳信號(hào)。用25%氯仿-甲醇溶解化合物A進(jìn)行ESI-MS分析。ESI(-)-MS：m/z=279.41[M-H]-，則 M=280.41。

表3 化合物A的C、H歸屬Table 3 C, H assignment of compound A

經(jīng)數(shù)據(jù)解析，并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定化合物A為亞油酸，分子式為C18H32O2，結(jié)構(gòu)如圖5所示。亞油酸可以作為醫(yī)藥品的原料，有研究表明，亞油酸具有降低體內(nèi)脂肪含量，防止動(dòng)脈硬化，抑制癌癥和腫瘤生成，同時(shí)它也可以增強(qiáng)人體免疫力，降低人體血液中膽固醇和血脂的作用[15]。

圖5 化合物A的結(jié)構(gòu)圖Fig.5 The structure of compound A

2.3.2 化合物B的結(jié)構(gòu)鑒定

用氘代氯仿溶解化合物B，得出的NMR數(shù)據(jù)如表4所示。化合物B的氫譜中有8種質(zhì)子信號(hào)，δ9.79為羧基的氫信號(hào)，δ5.37為雙鍵的氫信號(hào)，δ2.81(4H, t)為處于兩個(gè)雙鍵之間的-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ2.07(4H, m)為-CH2-CH=CH-中-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ1.65(2H, s)為 C-3上的-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ1.33(8H, m)為 C-4～C-7上的-CH2-質(zhì)子信號(hào)，δ0.95為末端甲基氫信號(hào)?；衔顱的碳譜中有 18個(gè)碳信號(hào)，其中δ130.23、δ130.09、δ130.03、δ128.08、δ127.98 和δ127.91 為-CH=CH-上的碳信號(hào)，δ33.68為-CH2-COOH中-CH2-信號(hào)，δ27.21為C-3上-CH2-碳信號(hào)，δ29.36、δ29.08、δ29.06和δ29.03為C-4～C7的-CH2-碳信號(hào)，δ27.19和δ22.58為C-8和C-17的碳信號(hào)，δ14.06為末端-CH3碳信號(hào)。用25%氯仿-甲醇溶解化合物 B進(jìn)行 ESI-MS分析。ESI(+)-MS：m/z=301.09[M+Na]+，則 M=278.09。

經(jīng)數(shù)據(jù)解析，并與文獻(xiàn)[16]比對(duì)，鑒定化合物B為α-亞麻酸，分子式為C18H30O2，結(jié)構(gòu)如圖6所示。

圖6 化合物B的結(jié)構(gòu)圖Fig.6 The structure of compound B

表4 化合物B的C、H歸屬Table 4 C, H assignment of compound B

α-亞麻酸是人體必需的油脂，具有降脂、降血壓、改善心血管疾病等作用，將其作為食品添加劑加入到食品中可用來預(yù)防和治療視力下降，心血管疾病，老年癡呆癥和癌癥等病癥[17]。α-亞麻酸對(duì)損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用，對(duì)部分癌細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)作用，能調(diào)節(jié)胰島素缺乏小鼠體內(nèi)脂肪和血糖代謝[18]，其眾多功效有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

3.1 本文通過比較古田紅曲和其它地區(qū)紅曲對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌作用研究，得出古田紅曲米相比其它地區(qū)紅曲具有較高的抗細(xì)菌活性這個(gè)結(jié)論，并以此為依據(jù)，選取古田紅曲米對(duì)其不同有機(jī)溶劑萃取物進(jìn)行了進(jìn)一步的抑菌研究，結(jié)果表明，不同有機(jī)溶劑萃取物對(duì)同一菌種的抑菌活性差別很大，同一溶劑萃取物對(duì)不同菌株的抑菌活性也不相同，其中乙酸乙酯和丙酮提取物的抑菌活性與其它有機(jī)溶劑提取物相比總體上來說具有較好的效果。此外，我們得出不同菌株對(duì)紅曲提取物的敏感度由大到小依次為：枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞黑曲霉＞塔賓曲霉＞釀酒酵母菌。同時(shí)，在以甲醇-水為洗脫劑對(duì)古田紅曲米不同極性洗脫液抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，50%水-甲醇洗脫液至 100%甲醇洗脫液這一部分相對(duì)而言具有較高的抗氧化活性。最后，對(duì)古田紅曲米甲醇提取物進(jìn)行了分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，成功分離出亞油酸和α-亞麻酸兩種活性物質(zhì)，這兩種活性物質(zhì)都具有一定的抗氧化，降血脂及抗腫瘤等生理活性作用，這在一定程度上驗(yàn)證了紅曲是具有功能性活性成分的藥食兩用的食材。

3.2 綜上，本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果為紅曲相關(guān)抑菌、抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論指導(dǎo)及借鑒作用，同時(shí)紅曲中的活性物質(zhì)為進(jìn)一步開發(fā)研究功能性紅曲產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

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