益氣固表丸對COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表達的影響

金　晶，馬　歡，王　晶，李風森

(新疆醫(yī)科大學1中醫(yī)學院，烏魯木齊　830011；2第一附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，烏魯木齊　830054；3附屬中醫(yī)醫(yī)院肺病科，烏魯木齊　830000；4新疆維吾爾自治區(qū)呼吸病研究重點實驗室，烏魯木齊　830002)

·中醫(yī)中藥·

益氣固表丸對COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表達的影響

金晶1,2，馬歡3，王晶4，李風森3

(新疆醫(yī)科大學1中醫(yī)學院，烏魯木齊830011；2第一附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，烏魯木齊830054；3附屬中醫(yī)醫(yī)院肺病科，烏魯木齊830000；4新疆維吾爾自治區(qū)呼吸病研究重點實驗室，烏魯木齊830002)

摘要：目的研究益氣固表丸對慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)模型大鼠肺組織中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4、5mRNA表達的影響。方法采用煙熏+脂多糖(LPS)氣管內(nèi)滴注方法建立COPD模型大鼠，造模成功后，將60只鼠齡為8 w的SPF級雄性Wistar大鼠隨機分為3組，分別為：空白組、對照組和實驗(益氣固表丸)組,每組20只，空白組和對照組大鼠給予生理鹽水灌胃，實驗組大鼠給予益氣固表丸相應劑量的水溶液灌胃，2次/d，連續(xù)12 w。采用Buxco系統(tǒng)檢測各組大鼠肺功能吸氣峰流速( Peak Inspiratory Flow，PIF)、呼氣峰流量( Peak Ex-piratory Flow，PEF)及每分鐘通氣量( Minute Volume，MV)，采用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin HE)染色法觀察大鼠肺組織形態(tài)學改變，RT-PCR方法檢測大鼠肺組織中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4、5mRNA表達的變化。結(jié)果與空白組比較，對照組大鼠肺功能PIF、PEF和MV下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與對照組比較，實驗組大鼠HE染色的炎癥細胞浸潤情況減輕，支氣管管腔直徑變寬，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白組比較，對照組大鼠肺組織 AQP-1、AQP-4、AQP-5mRNA 表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與對照組比較，實驗組大鼠肺功能PIF、PEF及MV均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與空白組比較，實驗組大鼠肺組織AQP-1、AQP-4、AQP-5mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論益氣固表丸能夠改善 COPD模型大鼠的肺通氣功能，升高大鼠肺組織中 AQ P-1、AQP-4和AQP -5蛋白表達。

關鍵詞：益氣固表丸；COPD模型大鼠；水通道蛋白

中圖分類號：R965

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2018)05-0649-04

要探索建立普通學生普及性地參與校園足球的強制機制，這是輸送專業(yè)足球人材和提高整體學生身體素質(zhì)的最基礎性的保證。如進一步細化、完善足球課的教學大綱，讓學生主動參與學習和訓練；進一步地完善足球課堂傷害事故的預防和善后工作，制定相關保險法律和法規(guī)；制定并推廣實行校園內(nèi)部級別的適合普通學生的足球等級制度(健身型的)，大力推廣班級、校際的各種、各級足球聯(lián)賽；制定各種相關的獎勵制度來引導和鼓勵學生及家長對校園足球的參與和支持。簡單地說，就是把校園足球和學校體育的各項活動完美的結(jié)合起來，互相促進，最終形成系列、完整的，由廣大學生積極參與的，成效顯著的制度和政策。

回歸分析是將非確定性變量之間的關系用能夠確定的函數(shù)關系表達出來。應用SPSS對體系中具體的7個影響因素進行相關性分析，通過相關性分析結(jié)果進行回歸分析，明確網(wǎng)購客戶物流配送滿意度的3個顯著影響因素，證明研究的有效性。

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.027

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金青年科學基金(2015211C157)

作者簡介：金晶(1981-)，女，在讀博士，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸病的中醫(yī)臨床診治。

通信作者：李風森，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合呼吸病研究，E-mail:fengsen602@163.com。

本文引用：金晶，馬歡，王晶,等.益氣固表丸對COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表達的影響[J].新疆醫(yī)科大學學報,2018,41(5):649-652.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.027

EffectsofYiqigubiaopillonexpressionofaquaporinmRNAinCOPDrats

JINJing1,2，MAHuan3，WANGJing4，LIFengsen3

(1CollegeofTraditionalChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2InternalMedicineDepartmentofTCM,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi, 830054,China;3PulmonaryDepartment,theAffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China；4XinjiangUygurAutonomousRegionKeyLaboratoryofRespiratoryDiseaseResearch,Urumqi830002,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of Yiqi gubiao pill on expression of Aquaporin(AQP)1,4and 5 mRNA in Chronic obstructive pulmonary disease(COPD)rat model.MethodsCOPD was induced by LPS injection and CS inhalation,60 SPF male Wistar rats at 8 weeks old were divided randomly into 3 groups:Blank group,Control group and Treatment(Yiqi biao pill)group(n=20 for every group).Blank group and Control group rats were fed saline lavage twice a day.Trail group rats were fed with Yiqigubiao solution twice a day as well.After 12 weeks,Wistar rat pulmonary function testing Buxco analysis system was used to examine lung function,such as Peak Inspiratory Flow(PIF),Peak Expiratory Flow(PEF),and Minute Volume(MV).HE staining was used to observe lung tissue pathology morphology,and RT-PCR method was used to detect expression of Aquaporin(AQP)1,4,5 mRNA in the lung tissue of rats.ResultsCompared with the Blank group,PIF,PEF and MV in the Control group were all decreased,and the difference was statistically significant(P<0.01).Compared with the Blank group,the expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 mRNA in lung tissues of rats decreased in the Control group,and the difference was statistically significant(P<0.01),Compared with the Control group,lung function indicators:PIF,PEF and MV in the Treatment group were all increased,and the differences were statistically significant(P<0.01).HE staining showed that the infiltration of inflammatory cells in Treatment group was significantly less than the Control group.The narrowing of the bronchial lumen was significantly improved,the diameter of the lumen was significantly wider.Compared with Model group,the expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 mRNA in the Treatment group was increased,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionYiqi gubiao pill can improve the pulmonary ventilation function in rats of COPD,and escalate protein expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 in lung tissues of mice.

Keywords:Yiqi gubiao pills;chronic obstructive pulmonary disease(COPD)rat model;aquaporin

氣道黏液高分泌狀態(tài)是慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)發(fā)病過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)，高黏蛋白含量增多，致使痰液黏稠，不易咳出，導致反復感染[1]。水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，廣泛存在于生物組織的內(nèi)皮細胞和表皮細胞膜上，與肺泡液體的轉(zhuǎn)運、氣道表面液體的調(diào)整、氣道濕化及鼻咽部分泌物的產(chǎn)生有關，AQP代謝失常是氣道黏液高分泌狀態(tài)的主要因素[2-3]，糾正AQP代謝失調(diào)對氣道高反應的影響，成為研究COPD預防和治療的切入點[4-5]。益氣固表丸是以“培土生金”為治則治療COPD的常用中成藥，由黨參、炒白術、茯苓、陳皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麥、紫蘇子、蜜款冬花、黃芩、伊貝母、蜜枇杷葉、防風共13味中藥組成，取“益氣為健運脾氣、固表為補益肺氣”之意，能夠有效改善證屬肺脾氣虛證COPD患者咳嗽痰多等呼吸道癥狀[6-7]，方中黨參為君藥，合白術、茯苓、半夏及陳皮以行 “二陳湯”之理氣和中燥濕之功效，輔以貝母止咳化痰，薏苡仁淡滲利濕，浮小麥及黃芩以滋陰斂汗而清肺之虛熱，紫蘇以祛風勝濕固表，余藥以清利肺氣，諸藥共參，以行補肺氣、化痰濕之效。本研究探究益氣固表丸對COPD模型大鼠呼吸道黏液分泌的影響，檢測大鼠肺組織中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4及5mRNA表達，為益氣固表丸的進一步臨床應用和開發(fā)提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物取SPF級鼠齡8 w的雄性Wistar大鼠60只，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2011-0004，實驗單位使用許可證號SCXK(新)2011-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，溫度(21±2)℃，濕度40%～50%，自由飲水，體質(zhì)量(200±50)g。

1.2試藥益氣固表丸購自新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中心藥房(新疆制藥廠，批號20121212)，脂多糖(Lipopolysaccharide LPS，美國Signa公司)，雪蓮過濾嘴香煙(新疆卷煙廠，烤煙型，焦油量13mg，煙氣煙堿量1.1mg，煙氣一氧化碳量13mg)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒(美國Invitrogen公司，批號 C11733-038)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司，批號 15596-026)，M-MLV First-Strand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號 C28025-032)，RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3儀器自制動物熏吸箱(60cm×50cm×40cm)，PLY3211型Wistar大鼠全身暴露型無創(chuàng)肺功能檢測分析系統(tǒng)(美國Buxco Electronics公司)，U-CMAD3 型顯微鏡(日本Olympus公司)，GX51型全自動圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)，YP102N型電子天平(上海天平儀器廠)，Milli-Q型純水處理儀(美國 Millipore公司)，-80℃低溫冰箱(德國 Thermo公司)，5418/5418R型高速臺式離心機(德國 Eppendorf公司)，Thermal cycler C1000型深孔PCR 儀(美國BIO-RAD公司)。

1.4COPD動物模型的建立及評價方法采用煙熏(CS)聯(lián)合彈性蛋白酶(LPS)氣管內(nèi)滴注方式建立COPD大鼠模型[8]，將大鼠放置于自制動物熏吸箱，煙霧濃度 450～500bpm進行熏煙，每次30min，每次間隔3h，每12小時更換煙盒1次，并于大鼠氣管內(nèi)滴注LPS 0.2mg /kg體質(zhì)量，連續(xù)12 w。造模第一天和最后一天(第84天)，分別稱取大鼠體質(zhì)量后放入檢測室(傳感器)，采用Wistar大鼠肺功能檢測Buxco系統(tǒng)檢測大鼠肺功能吸氣峰流速(Peak Inspiratory Flow，PIF)、呼氣峰流量(Peak Ex-piratory Flow，PEF)和每分鐘通氣量(Minute Volume，MV)，與空白組大鼠比較，以上指標下降幅度>30%即為COPD模型成功。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白組大鼠(n=20)、對照組(n=20)、實驗(益氣固表丸)組(n=20)。按照人與動物間體表面積折算等效劑量公式[9]折算相應劑量，實驗組大鼠每日灌藥量為513mg/kg體質(zhì)量，空白組和對照組大鼠每天灌胃0.9%生理鹽水6.6mL，實驗組大鼠灌胃益氣固表丸水溶液6.6mL，每天2次，所有大鼠在給藥期間正常喂食,灌胃12 w后處死，取出肺組織，備用。

1.5病理標本的制作取每組大鼠左肺組織，在垂直于支氣管的肺矢狀面最大周徑處取材，取厚約5mm的肺組織，剪成面積為1.5cm2左右的小塊，浸入2mL的4%多聚甲醛溶液中固定，用PBS緩沖液洗滌，并浸泡在固定劑24h后，石蠟包埋，將標本切成3～4μm并加工用于HE染色。

1.6肺組織AQPmRNA的檢測取每組大鼠右肺組織100mg，依據(jù)Trizol試劑說明書提取組織總RNA，PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴增目的基因，引物由上海生工生物技術有限公司合成。反應總體系為25μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，拍照并讀取灰度值，分析AQP1、AQP4、AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化情況，見表1。

表1　AQP1、AQP4、AQP5 引物序列表

2　結(jié)果

2.1大鼠肺組織形態(tài)學觀察空白組大鼠支氣管結(jié)構及肺泡結(jié)構清晰，支氣管未見明顯收縮，未見明確炎癥細胞浸潤，氣道上皮排列整齊，管腔規(guī)則。對照組大鼠支氣管及肺泡組織結(jié)構紊亂，部分結(jié)構消失，支氣管黏膜可見大量炎癥細胞浸潤，支氣管出現(xiàn)收縮的現(xiàn)象，管腔變窄，氣道上皮排列不整齊，甚至出現(xiàn)斷裂的情況。實驗組較對照組大鼠支氣管炎癥細胞浸潤情況減輕，支氣管收縮好轉(zhuǎn)，管腔變窄情況改善，管腔直徑變寬，見圖1。

圖1　大鼠肺組織HE染色結(jié)果(×200)

2.2各組大鼠肺功能比較與空白組比較，對照組大鼠PIF、PEF 和 MV降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與對照組比較，實驗組大鼠PIF、PEF、MV升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3各組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-4、AQP-5的mRNA表達比較與空白組比較，對照組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-4、AQP-5 mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與對照組比較，實驗組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-5 mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，AQP-4mRNA無變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

2.4AQP-1、AQP-4和AQP-5mRNA表達與肺功能的相關性分析各組大鼠肺組織中 AQP-1、AQP-5 蛋白表達與大鼠PIF、PEF和MV指標均呈負相關(r分別為-0.835 4、-0.7642、-0.7524)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組大鼠肺組織中AQP-4mRNA表達與大鼠 PIF、PEF 和 MV 均呈負相關(r分別為-0.245 5、-0.368 8、-0.376 8)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2　各組大鼠肺功能指標的比較

注:與空白組比較，*P<0.01;與對照組比較，△P<0.01。

表3　各組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-4、AQP-5表達的影響

注:與空白組比較，*P<0.01;與對照組比較，△P<0.01。

3　討論

COPD證屬中醫(yī)學“肺脹”范疇，“痰飲蘊肺”是在“肺脹”發(fā)展過程的重要證候[10]?，F(xiàn)代中醫(yī)學者將“整體觀”、“辨證觀” 與多種組學信息相結(jié)合，建立系統(tǒng)生物學與中醫(yī)證候相結(jié)合的“系統(tǒng)-系統(tǒng)”的研究[11]。有學者[12-13]認為高分泌是“痰飲”的物質(zhì)基礎，使用健脾益肺化痰方，通過抑制“ILl3-pSTAT6-MUC5AC”信號通路改善 COPD大鼠氣道黏液高分泌狀態(tài)。詹少鋒等[14]發(fā)現(xiàn)益氣化痰方能夠抑制COPD模型小鼠Muc5ac和 AQP -5的蛋白表達，認為“肺主通調(diào)水道”與現(xiàn)代研究對 COPD在細胞免疫、炎癥及黏液高分泌狀態(tài)的病理本質(zhì)認知是相一致的。祝小惠等[15]應用“從腸論治”法促進COPD模型大鼠肺組織AQP s mRNA的表達，改善氣道炎癥及表面液體的調(diào)節(jié)功能。尚立芝等[16]應用愛羅咳喘寧方上調(diào)COPD模型大鼠支氣管組織AQP5、抑制MUC5AC 基因表達，改善局部氣道濕化作用。

本研究探討慢性氣道炎癥環(huán)境下“痰飲”的物質(zhì)基礎，發(fā)現(xiàn)COPD模型大鼠肺功能下降的同時肺組織中AQP-1、AQP-4及AQP-5mRNA表達降低，說明AQP-1、 AQP- 5mRNA表達降低可能引起的氣道內(nèi)水轉(zhuǎn)運功能下降，在炎性因素的刺激下容易導致氣道黏液分泌過多，產(chǎn)生氣道阻塞。益氣固表丸能夠使AQP-1、AQP-5mRNA表達升高，促進呼吸道水轉(zhuǎn)運功能，調(diào)節(jié)呼吸道液體轉(zhuǎn)運，減少痰液產(chǎn)生，減輕氣道高分泌狀態(tài)，減少氣道阻塞，從而起到降低氣流受限的作用。

[收稿日期：2017-11-10]

(本文編輯施洋)