金櫻子提取物對小鼠結(jié)腸炎腸黏膜的保護作用

邊　晨，劉　新，張　揚，邢　靜，阿依古扎麗·熱合曼，張坤坤，白　杰，代紅燕

(新疆醫(yī)科大學1臨床醫(yī)學2013-2班；2基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學教研室；3本碩2014-4班；4基礎(chǔ)醫(yī)學院機能中心，烏魯木齊　830011)

金櫻子提取物對小鼠結(jié)腸炎腸黏膜的保護作用

邊晨1，劉新2，張揚3，邢靜1，阿依古扎麗·熱合曼3，張坤坤1，白杰2，代紅燕4

(新疆醫(yī)科大學1臨床醫(yī)學2013-2班；2基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學教研室；3本碩2014-4班；4基礎(chǔ)醫(yī)學院機能中心，烏魯木齊830011)

摘要：目的探討金櫻子果實中總黃酮與多糖2,4,6 -三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的克羅恩病(CD)小鼠的黏膜保護作用。方法將140只KM小鼠分為空白對照組、模型組、5-氨基水楊酸(5-ASA)組、總黃酮高、低劑量組和多糖高、低劑量組，空白對照組正常飼養(yǎng)，其余各組小鼠利用TNBS建立CD模型，空白對照組給予等計量的蒸餾水，多糖高劑量組、低劑量組分別給予多糖6 g·kg-1·d-1、3 g·kg-1·d-1，總黃酮高劑量組、低劑量組分別給予黃酮4g·kg-1·d-1、2 g·kg-1·d-1，5-ASA組給予5-ASA 0.5 g·kg-1·d-1。每日1次，連續(xù)灌胃21d，處理動物。取小鼠結(jié)腸組織記錄長度和重量，取固定結(jié)腸部位HE染色，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)含量。結(jié)果TNBS誘導的小鼠CD模型中，金櫻子總黃酮和多糖可以降低小鼠結(jié)腸重量/長度比值、病理評分和結(jié)腸組織中TNF-α和IFN-γ表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是各組間生存率差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論在該模型中金櫻子果實提取物可以降低小鼠結(jié)腸重量/長度比值，改善結(jié)腸炎癥水腫程度，降低結(jié)腸組織中TNF-α和IFN-γ含量,因此金櫻子果實提取物對CD小鼠有一定治療作用。

關(guān)鍵詞：金櫻子；克羅恩病；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；干擾素-γ(IFN-γ)

中圖分類號：R965.2

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2018)05-0597-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.017

基金項目：國家大學生創(chuàng)新性試驗計劃項目(CX2016016)

作者簡介：邊晨(1994-)，男，在讀本科，研究方向：腸道炎癥與免疫。

通信作者：白杰，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：腸道炎癥與免疫，E-mail:2250018725@qq.com。

通信作者：代紅燕，女，碩士，高級實驗師，研究方向：心血管及消化藥理學，E-mail:414941636@qq.com。

本文引用：邊晨，劉新，張揚,等.金櫻子提取物對小鼠結(jié)腸炎腸黏膜的保護作用[J].新疆醫(yī)科大學學報,2018,41(5):597-601.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.017

TheprotectiveeffectofRosalaevigataFructusextractontheintestinalmucosaofmicecolitis

BIANChen1，LIUXin2，ZHANGYang3，XINGJing1，AyiguzhaliRahman3，ZHANGKunkun1，BAIJie2，DAIHongyan4

(1ClinicalMedicineClass2013-2；2DepartmentofPharmacology，SchoolofPharmacy,3Combinedbachelor-masterDegreeProgramme2014-4，4FunctionalCenter,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoids and polysaccharides of Rosa Laevigata Fructus on the mucosal protection of crohn′s disease(CD)induced by TNBS.MethodsThe 140 KM mice were divided into no-treatment control group,model group,positive drug group,flavonoids high,low dose group and polysaccharide high and low dose group,using TNBS to established the CD model.By intragastric administration,then colonic tissue was collected after 21 days,the length and weight were measured,and the colonic area was collected for HE,and the contents of TNF-α and IFN-γ in the colon tissues were determined by ELISA.ResultsThere was significant difference in colon weight/length and content of TNF-α and IFN-γ between the model group and the no-treatment control group(P<0.05).However,there was no statistically significant difference in survival rate between the groups.ConclusionThis study showed the therapeutic effect of the extract of Rosa Laevigatae Fructus on CD mice.In this model,the extract of Rosa Laevigatae Fructus can reduce the ratio of colon weight/length in mice,and improve the degree of inflammation of the colon and decrease the content of TNF-α and IFN-γ in the colon tissues.

Keywords:Rosa Laevigata Fructus;crohn's disease;TNF-α;IFN-γ

克羅恩病( Crohn’s disease，CD)是一種病因不明的胃腸道進行性肉芽腫性疾病，從口腔至肛門的整個消化道均可受累，通常發(fā)生于回腸末端和鄰近結(jié)腸，呈階段性、跳躍性分布，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、瘺管、肛門病變等。我國CD的發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1-2]。CD的發(fā)病機制尚不明確，目前認為主要與免疫異常有關(guān)[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學對 CD的常規(guī)藥物治療主要包括5-氨基水楊酸制劑(5-ASA)、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗腫瘤壞死因子(TNF)制劑、抗生素、益生菌等，由于常規(guī)藥物在治療有效性和安全性上存在局限性，近年來，如抗黏附分子、抗細胞因子、T細胞標記物等新型生物制劑逐漸成為研究重點，這些藥物起效快，但也存在如價格昂貴、引發(fā)血液系統(tǒng)惡性病變等不足。中醫(yī)藥在本病的治療方面有一定的療效[4-5]。

金櫻子作為常用中藥，已有悠久的歷史，早在《本草綱目》中就有記載金櫻子“性酸、澀、平、無毒;主治脾瀉下痢、止小便利、澀精氣，久服，令人耐寒輕身，補血益精，有奇效”。近年來的研究表明金櫻子具有抗氧化、抑菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降糖降脂、保護腎臟等多種藥理作用[6-8]。本研究以2,4,6 -三硝基苯磺酸(TNBS)誘導小鼠結(jié)腸炎癥建立克羅恩病模型，考察金櫻子果實提取的總黃酮和多糖對小鼠結(jié)腸黏膜炎癥的治療作用，并初步探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物KM小鼠140只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，普通環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2實驗藥材與試劑金櫻子(新疆百草堂醫(yī)藥連鎖公司提供)，TNBS(Sigma公司)，蘆丁(S90103，北京索萊寶公司)，蒽酮(A7160，北京索萊寶公司)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)，蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，伊紅染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，環(huán)保透明脫蠟液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，石蠟(萊卡公司，德國)，無水乙醇、濃硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁(均為國產(chǎn)分析純)。

1.3實驗儀器小型多功能提取濃縮回收機組(北京舜甫有限公司)，粉碎機(杭州旭眾機械設備有限公司)，分光光度計(上海光學儀器五廠有限公司)，石蠟包埋機(萊卡Leica EG1150，德國)，切片機(萊卡RM2235，德國)，酶標儀(VarioSkan Flash，美國)，圖像采集系統(tǒng)(萊卡三目顯微鏡DM3000B，德國)。

1.4實驗方法

1.4.1總黃酮提取與濃度測定挑選金櫻子完整干燥果實，用粉碎機粉碎，去除堅硬種子，整理和收集粉碎后部分。按照料液比1∶6加入40%乙醇，提取溫度80℃，提取時間為5 h，進行總黃酮的提取[9]。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇后，冷凍干燥，收集焦糖色物質(zhì)，置于干燥處保存。準確稱取蘆丁標準品10.0mg置于25mL容量瓶中，加90%乙醇溶解，定容，準確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于10mL容量瓶中，加10%亞硝酸鈉0.1mL 放置6min，再加5%硝酸鋁0.5mL，放置6min加5%氫氧化鈉4mL，補純凈水至刻度搖勻靜置6min，以510 nm處測吸光度。依據(jù)吸光度和濃度計算標準曲線和R2，計算金櫻子果實中40%醇提物總黃酮的含量。

1.4.2多糖提取與濃度測定挑選金櫻子完整干燥果實，用粉碎機粉碎，去除堅硬種子，整理和收集粉碎后部分。按照料液比1∶4加入蒸餾水，提取溫度90℃，提取時間為3h，對多糖進行提取，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去部分水后，冷凍干燥，收集焦糖色物質(zhì)，置于干燥處保存。依據(jù)《中國藥典》采用硫酸-蒽酮法制作標準曲線，計算金櫻子果實提取物中多糖含量。

1.4.3CD模型建立將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、5-ASA組、多糖高劑量組、多糖低劑量組、總黃酮高劑量組和總黃酮低劑量組，每組20只，雌雄各半?？瞻讓φ战M不給予TNBS，正常飼養(yǎng)。其余各組小鼠剃毛后，于皮膚外涂抹TNBS 3.75mg(溶于48%乙醇)，于外涂TNBS 后的第7、14和21天時，各組小鼠直腸1.0～2.0cm處分別給予TNBS 0.75、1.5和2.25mg(溶于40%乙醇)，期間觀察與正常對照組比較是否表現(xiàn)為腹瀉、皮毛粗糙和活力減弱等現(xiàn)象，確認CD小鼠模型建立[10]。

1.4.4藥物治療對CD模型小鼠通過灌胃方式給藥，每日1次，連續(xù)灌胃21d。正常對照組給予等計量的蒸餾水，多糖高劑量組、低劑量組分別給予多糖6 g·kg-1·d-1、3 g·kg-1·d-1[11]，總黃酮高劑量組、低劑量組分別給予黃酮4g·kg-1·d-1、2 g·kg-1·d-1，5-ASA組采用臨床劑量，換算成小鼠用量為0.5 g·kg-1·d-1。

1.4.5動物觀察與處理每日觀察小鼠狀態(tài)、糞便性狀和稱重并詳細記錄。處死后取出結(jié)腸組織稱重后測量長度，在距離肛門5～10cm處剪取結(jié)腸組織。取1cm組織浸泡于10%福爾馬林溶液中，固定36h后常規(guī)脫水，包埋。剩余組織放入凍存管中-80℃保存?zhèn)溆?。包埋腸組織進行切片，HE染色制成病理切片，在顯微鏡下觀察，拍攝照片并進行病理評分(CMDI)，評分標準如下：潰瘍：分3級，0級：無；1級：小潰瘍(直徑<3mm);2級：大潰瘍(直徑>3mm)炎癥：0級：無;1級：輕度;2級：重度。

1.4.6TNF-α和IFN-γ測定將冰凍結(jié)腸組織制成組織勻漿，離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒檢測結(jié)腸組織勻漿上清液中TNF-α以及IFN-γ的表達水平，以其表達水平表征結(jié)腸組織炎癥的程度，具體操作參照試劑盒說明書中的詳細步驟。

2　結(jié)果

2.1多糖及總黃酮濃度根據(jù)硫酸-蒽酮法制作標準曲線后，測得金櫻子果實提取物中多糖純度為35.12%；根據(jù)蘆丁標準品作標準曲線后，測得金櫻子果實提取物中總黃酮純度為2.79%。

2.2小鼠存活率記錄給藥期間各組小鼠的死亡只數(shù)，計算其終點生存率。模型組小鼠的終點生存率最低，與模型組比較，總黃酮提取物組、多糖提取物組和5-ASA組的小鼠存活率較高，但并無統(tǒng)計學差異。其中空白對照組由于灌胃操作原因?qū)е滦∈螽攬鏊劳?，其余各組無此類現(xiàn)象，見表1。

2.3結(jié)腸重量/長度比值與空白對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸重量/長度比值明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，金櫻子總黃酮組、多糖組和5-ASA組小鼠結(jié)腸重量/長度比值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。金櫻子總黃酮提物組、多糖提取物組和5-ASA組小鼠結(jié)腸重量/長度比值比較，無明顯差異。提示金櫻子總黃酮與多糖均能改善TNBS誘導的CD模型小鼠結(jié)腸組織的炎癥水腫程度，見圖1。

表1　給藥后各組小鼠存活情況

2.4病理分析小鼠結(jié)腸組織切片HE病理分析結(jié)果表明，空白對照組小鼠結(jié)腸組織未見明顯病變。模型組小鼠結(jié)腸組織病變明顯，主要表現(xiàn)為上皮組織上皮細胞缺失、糜爛和淺潰瘍形成，腺體密度降低，黏膜固有層有大量炎癥細胞浸潤，肌層增厚。金櫻子總黃酮高劑量組、多糖高劑量組以及5-ASA組的小鼠結(jié)腸組織與空白對照組相似，無明顯炎細胞浸潤。金櫻子總黃酮低劑量組和多糖低劑量組小鼠結(jié)腸組織可見少量炎細胞浸潤，但無明顯上皮細胞病變。采用結(jié)腸病灶病理組織顯微鏡檢查并進行CMDI評分，模型組評分為(7.3±1.03)分，明顯高于其他各組，見圖2、圖3。

2.5TNF-α和IFN-γ結(jié)果通過ELISA試劑盒測定小鼠結(jié)腸組織細胞因子TNF-α和IFN-γ結(jié)果顯示，模型組TNF-α、IFN-γ水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，金櫻子總黃酮提取物組、多糖提取物組和5-ASA組小鼠結(jié)腸TNF-α和IFN-γ水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。金櫻子總黃酮提取物組、多糖提取物組和5-ASA組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IFN-γ水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見圖4、圖5。提示金櫻子總黃酮提取物與多糖提取物能有效降低TNBS誘導的CD模型小鼠結(jié)腸組織的炎癥水平。

圖2　各組小鼠結(jié)腸組織HE病理染色結(jié)果(100×)

3　討論

研究結(jié)果顯示，金櫻子果實中總黃酮和多糖提取物雖然不能提高小鼠的存活率，但是，可以降低結(jié)腸重量/長度比值，改善結(jié)腸炎癥水腫程度，同時可以降低TNF-α和IFN-γ的表達水平，改善結(jié)腸炎癥水平，從而改善CD相關(guān)癥狀，與5-ASA相比具有一定治療作用。

細胞因子與CD的發(fā)病密切相關(guān)，其中TNF-α和IFN-γ為重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，TNF-α在炎癥反應過程中是出現(xiàn)最早和最重要的炎性介質(zhì)，它能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內(nèi)皮細胞通透性增加，調(diào)節(jié)組織代謝活性并促進細胞因子的合成和釋放。研究表明[12]，TNF-α和IFN-γ通過激活骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)導致目的檢測核因子κB(NF-κB)/轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)通路活化，24h預處理的MSCs通過尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)后，組織中的促炎因子IL-17、TNF-α、IL-1B、IFN-γ表達水平均明顯增加。因此，通過降低TNF-α和IFN-γ的表達水平，可以降低腸道炎癥水平以達到緩解病情的目的。

本研究結(jié)果表明，金櫻子果實中總黃酮提取物與多糖提取物能有效降低TNBS誘導的CD模型小鼠結(jié)腸組織的TNF-α和IFN-γ含量，今后考慮進一步研究有關(guān)NF-κB和MAPK相關(guān)炎癥通路，進一步闡述金櫻子改善CD的作用機制。

[收稿日期：2017-11-05]

(本文編輯楊晨晨)