AGR2在垂體腺瘤組織中的表達(dá)及其與腫瘤侵襲性的關(guān)系

麥麥提依明·托合提　文國(guó)道　唐超　李俊漾　胡躍兵　馬馳原*

(1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊 830001; 2南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院神經(jīng)外科, 江蘇 南京 210002)

垂體腺瘤(pituitary adenomas, PAs)是最常見(jiàn)的顱腦腫瘤之一，約占全部顱腦腫瘤的10%[1]。絕大多數(shù)垂體瘤被認(rèn)為是良性腫瘤，然而部分腫瘤可以侵襲鄰近結(jié)構(gòu)如蝶竇、海綿竇，甚至是腦組織，不但引起相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，更使垂體腺瘤的外科治療加倍困難，故垂體腺瘤的早期診治極其重要。本部分實(shí)驗(yàn)主要研究人類(lèi)前提度蛋白2(anterior gradient 2, AGR2)在垂體腺瘤組織中的表達(dá)和分布；評(píng)價(jià)AGR2與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系。

材料與方法

一、病例資料的收集

收集2013年5月至2014年7月在我院神經(jīng)外科經(jīng)手術(shù)切除的垂體腺瘤新鮮標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)本院病理科確診為垂體腺瘤。標(biāo)本分成兩份，一份浸泡在4%多聚甲醛中，另一份經(jīng)生理鹽水沖洗后立即放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

腫瘤標(biāo)本入選標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為垂體腺瘤者；②發(fā)病后隨訪時(shí)間超過(guò)兩年者；③影像學(xué)能明確侵襲性或非侵襲性者；④單一分泌類(lèi)型的垂體腺瘤者。腫瘤標(biāo)本排除標(biāo)準(zhǔn)：①垂體腺瘤卒中或者囊變者；②發(fā)病后隨訪時(shí)間低于兩年者；③影像學(xué)不能明確侵襲性或非侵襲性者；④診斷為混合型垂體腺瘤者；⑤標(biāo)本較小無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)者。

所收集垂體腺瘤組織標(biāo)本共117例。其中無(wú)功能性(non-functioning, NF)腺瘤組織56例，生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)腺瘤組織24例，泌乳素(prolactin, PRL)腺瘤組織24例，促性腺激素(follicle stimulating hormone, FSH)腺瘤組織8例，促腎上腺皮質(zhì)激(adenocorticotropic hormone, ACTH)腺瘤組織5例。根據(jù)垂體腺瘤Hardy分類(lèi)法和Knosp分類(lèi)法將垂體腺瘤分為侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤[2]。其中侵襲性垂體腺瘤70例，非侵襲性垂體腺瘤47例。

二、方法與試劑

1.免疫組化染色：將新鮮腫瘤組織常規(guī)石蠟包埋后用切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5 μm，并按免疫組織化學(xué)染色步驟對(duì)其進(jìn)行染色，免疫組化用常規(guī)的SABC法，抗AGR2抗體(稀釋比例為1/400)來(lái)自美國(guó)CST公司。染色強(qiáng)度分為0(陰性)，1(弱陽(yáng)性)，2(中度陽(yáng)性)，3(強(qiáng)陽(yáng)性)。根據(jù)陽(yáng)性范圍占整個(gè)切片的百分比將染色范圍分為0(0%)，1(1%～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(76%～100%)。每張切片染色強(qiáng)度的分值加染色范圍的分值為該張切片的總分(0～7分)。總分大于2分被認(rèn)為是陽(yáng)性，其中2～3分為低表達(dá)，大于3分為高表達(dá)。

2.免疫熒光染色：將新鮮組織常規(guī)石蠟包埋后用切片機(jī)連續(xù)切片，厚度為5 μm，并按免疫熒光染色步驟對(duì)其進(jìn)行染色，其中抗AGR2抗體(稀釋比例為1/400)來(lái)自美國(guó)CST公司。最后用熒光顯微鏡鏡檢拍照并采集圖像。

3.免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)法：將按照Western blot分離膠和濃縮膠的配置方案(上海碧云天)配置分離膠和濃縮膠，其中分離膠濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，將按照蛋白提取試劑盒(上海碧云天)說(shuō)明書(shū)提取的蛋白放入加樣孔并按說(shuō)明書(shū)依次完成相關(guān)步驟，最后采用Image J圖像分析軟件分析條帶上目標(biāo)分子的平均灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用卡方檢驗(yàn)比較AGR2在侵襲與非侵襲性垂體腺瘤的表達(dá)差異。AGR2表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系使用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1垂體腺瘤組織免疫組化染色(×200)

Fig 1Expression of AGR2 in PAs(×200)

A: High expression of AGR2 (++); B: Low expression of AGR2 (+); C: AGR2 negative. AGR2 was mainly located in the membrane and cytoplasm. The results showed that AGR2 expression could be highly expressed in the non-invasive PAs (A) and it was hardly observed in the invasive PAs (C).

Bar=10 μm.

結(jié)　　果

一、AGR2在垂體腺瘤組織中的表達(dá)

垂體腺瘤組織AGR2免疫組化染色結(jié)果如圖1所示。在117例組織標(biāo)本中，共60例組織標(biāo)本AGR2表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為51.3%。不同分泌類(lèi)型的垂體腺瘤中ACTH腺瘤陽(yáng)性率最高，為80.0%(4例)，其次分別為FSH腺瘤(75.0% 6例)、GH腺瘤(62.5% 15例)、NF腺瘤(44.6% 25例)，陽(yáng)性率最低為PRL腺瘤(41.7% 10例)。AGR2在垂體腺瘤不同分泌類(lèi)型中的表達(dá)無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.537,P=0.162>0.05)。

圖2顯示對(duì)垂體腺瘤不同亞型的Western blot結(jié)果。在垂體腺瘤不同亞型中AGR2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)顯著差異，在不同分泌類(lèi)型的垂體腺瘤組織中均有不同水平AGR2蛋白表達(dá)。

二、AGR2在垂體腺瘤組織細(xì)胞中的分布

圖3顯示垂體腺瘤免疫熒光染色結(jié)果。結(jié)果提示：在垂體腺瘤組織AGR2免疫熒光染色中，AGR2(綠色)與4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino- 2-phenylindole DAPI)(藍(lán)色)幾乎無(wú)重疊，表明在垂體腺瘤細(xì)胞中，AGR2蛋白定位胞漿和胞膜中，與免疫組化染色結(jié)果相一致。

圖2垂體腺瘤組織不同亞型的AGR2的表達(dá)

Fig 2The expression of AGR2 in different PAs subtypes detected by Western blot

PRL: Prolactin-secreting PAs; GH: Growth hormone secreting PAs; ACTH: Adenocorticotropic hormone secreting PAs; FSH: Follicle stimulating hormone secreting PAs; NF: Non-functioning PAs.

β-actin was served as loading control. S1 represents Sample 1 and S2 represents Sample 2.

三、垂體腺瘤中AGR2的表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系

垂體腺瘤組織中AGR2的表達(dá)與各臨床因素的關(guān)系如表1所示。結(jié)果所示，垂體腺瘤中AGR2的表達(dá)水平高低僅與腫瘤的侵襲性有顯著相關(guān)(P<0.001)，與患者性別、年齡、腫瘤是否復(fù)發(fā)及腫瘤的大小無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05)，在大多數(shù)侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2表達(dá)陰性，而在大多數(shù)非侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2表達(dá)陽(yáng)性。垂體腺瘤中AGR2的表達(dá)水平高低與。對(duì)垂體腺瘤組織的Western blot結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)果(圖4)。

表1垂體腺瘤患者臨床病例特征與AGR2表達(dá)的關(guān)系 [n(%)]

Tab 1Association between AGR2 expression and clinical pathological characteristics from patients with PAs [n(%)]

ParameternAGR2-+ Cases11757(48.7)60(51.3) Male65(55.5)32(27.4)33(28.1) Female52(44.5)25(21.4)27(23.1) Age (years) ≤5067(57.3)30(25.6)37(31.7) >5050(42.7)27(23.1)23(19.6) Invasive Yes70(59.8)46(39.3)24(20.5)a No47(40.2)11(9.4)36(30.8) Recurrence Yes12(10.3)7(6.0)5(4.3) No105(89.7)50(42.7)55(47.0) Tumor size ≤10 mm13(11.1)4(3.4)9(7.7) >10 mm104(88.9)53(45.3)51(43.6)

aP<0.001,vsnon-invasive PAs group.

圖3垂體腺瘤組織免疫熒光染色(×400)

Fig 3Immunohistofluorescence staining for expression and distribution of AGR2 in PAs (×400)

A1, B1：Immunohistofluorescent staining of AGR2 (green); A2, B2: The counterstained images of nucleus with DAPI (blue); A3, B3: The merged images of AGR2 (green) and DAPI (blue).

AGR2 was mainly located in the membrane and cytoplasm. The number of AGR2-positive cells was expressed as percentage of total cells. It showed that AGR2 expression could be highly expressed in the non-invasive PAs (A1～A3), and it was hardly observed in the invasive PAs (B1～B3).

Bar=20 μm.

圖4垂體腺瘤組織AGR2的表達(dá)與腫瘤侵襲性的關(guān)系

Fig 4The expression of AGR2 in invasive or non-invasive PAs

討　　論

垂體腺瘤以其腫瘤生物學(xué)特性可分為非侵襲性垂體腺瘤、侵襲性垂體腺瘤以及垂體腺癌。其中，非侵襲性微腺瘤由于腫瘤體積小、缺乏特異性臨床表現(xiàn)，早期難以發(fā)現(xiàn)。侵襲性垂體腺瘤約占垂體腺瘤30%～55%，它具有高增殖活性、高侵襲能力、術(shù)后易復(fù)發(fā)、臨床治愈率低等特點(diǎn)[3]。侵襲性垂體腺瘤被發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤體積多已巨大，并常侵犯海綿竇等多個(gè)腫瘤周?chē)匾Y(jié)構(gòu)，因此外科手術(shù)切除率和病情緩解率遠(yuǎn)低于非侵襲性垂體腺瘤[4]。因此，垂體腺瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療至關(guān)重要。

AGR2是源于非洲爪蟾蛋白XAG2(Xenopus anterior gradient 2)的人型同系物，它在爪蟾胚胎的生理發(fā)育生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[5]。目前，關(guān)于AGR2在對(duì)人體的生理作用尚不清楚。AGR2 主要和激素依賴(lài)性腫瘤相關(guān)，例如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌等。AGR2 在一些腫瘤中表現(xiàn)出了明顯的致癌基因的相關(guān)特征，例如促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤耐藥等，它還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[6-8]。然而，在肝癌、結(jié)直腸癌以及鼻咽癌中，AGR2 表達(dá)下降被認(rèn)為與患者較差的預(yù)后有密切的關(guān)系[9-11]。所以AGR2 在不同的腫瘤中的表達(dá)有很大的差異，其在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中的作用也有很大的差異。

文獻(xiàn)報(bào)道，AGR2的表達(dá)缺失在腸息肉患者腸組織異常增生到癌變進(jìn)展過(guò)程中起重要作用[10]。Riener等發(fā)現(xiàn)AGR2在結(jié)腸癌細(xì)胞系以及結(jié)腸癌組織標(biāo)本中的低表達(dá)可能與腫瘤低分化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。亦有人認(rèn)為AGR2可能是原發(fā)性結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的獨(dú)立指標(biāo)之一。在本研結(jié)果表明，在117例不同分泌類(lèi)型的垂體腺瘤組織中，AGR2陽(yáng)性率僅為51.3%。雖然不同分泌類(lèi)型垂體腺瘤組織中AGR2的表達(dá)略有不同，其表達(dá)率從高到低分別為ACTH腺瘤(80.0%)，F(xiàn)SH腺瘤(75.0%)，GH腺瘤(62.5%)，NF腺瘤(44.6%)以及PRL腺瘤(41.7%)，AGR2在不同分泌類(lèi)型的垂體腺瘤組織中的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異(P>0.05)。我們還分析了垂體腺瘤相關(guān)臨床特征與腫瘤組織中AGR2表達(dá)水平的關(guān)系，結(jié)果表明腫瘤侵襲性與AGR2的表達(dá)水平顯著相關(guān)(P<0.001)。在大多數(shù)侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2表達(dá)陰性，而在大多數(shù)非侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2的表達(dá)陽(yáng)性，這與Riener等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的。關(guān)于AGR2在垂體腺瘤組織致侵襲性或者癌變中的作用機(jī)制可能需要更多的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示。

本研究中，我們檢測(cè)了117例垂體腺瘤組織標(biāo)中AGR2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，AGR2在非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于侵襲性者。AGR2不僅能作為研究垂體腺瘤侵襲性的靶標(biāo)，還能作為垂體腺瘤診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。