STIL在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)及其預(yù)后價值

袁勇剛，李文娟，周杭城，彭　燕，王　偉，胡　冰

肝細(xì)胞癌，簡稱肝癌，是常見的消化道惡性腫瘤之一，具有易侵襲轉(zhuǎn)移等特點，患者預(yù)后極差[1-2]。目前有關(guān)肝癌診療及找尋預(yù)測預(yù)后的有效生物學(xué)指標(biāo)是該領(lǐng)域的研究熱點。STIL(SCL/TAL1 interrupting locus，STIL)基因是從人類急性T淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)染色體重排中克隆而來，其進(jìn)化高度保守，主要與中心體形成及數(shù)目調(diào)控、紡錘體形成和染色體分離密切相關(guān)[3-4]。研究[5-6]表明，STIL還可作為一種癌基因在肺癌、胰腺癌等組織中表達(dá)增高，且其高表達(dá)與腫瘤侵襲及預(yù)后有關(guān)，但在肝癌中的表達(dá)及預(yù)后意義尚未見詳細(xì)報道。該研究采用生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合免疫組化驗證的方法探討STIL在肝癌中的表達(dá)水平及其預(yù)后價值。

1　材料與方法

1.1生物信息學(xué)預(yù)測選擇癌癥公共數(shù)據(jù)庫Oncomine和TCGA進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測。在Oncomine數(shù)據(jù)庫中輸入基因名“STIL”和差異基因分析模塊輸入“Hepatocellular carcinomavsnormal”檢索分析結(jié)果；下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌數(shù)據(jù)，共有364例肝癌患者具有STIL基因表達(dá)的信息，按其表達(dá)水平高低降序排列，排名前50%計為STIL高表達(dá)(182例)，排名后50%計為STIL低表達(dá)(182例)，而后與患者的總生存期(overall survival，OS)關(guān)聯(lián)，運(yùn)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

1.2肝癌患者標(biāo)本及其臨床病理資料回顧性收集2010年6月～2016年9月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院行肝切除術(shù)的肝癌患者(共計67例)的癌與癌旁配對的石蠟組織標(biāo)本，術(shù)后病理均證實肝癌，隨訪時間截止到2017年9月?；颊呦嚓P(guān)的臨床信息包括：性別、年齡、腫瘤大小、有無肝硬化、有無脈管侵犯、TNM分期等。本研究已經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會審批，所有患者已簽署知情同意書。

1.3免疫組化染色及結(jié)果判讀采用免疫組織化學(xué)染色SP法對上述標(biāo)本進(jìn)行檢測，具體操作方法按照試劑說明書進(jìn)行。一抗為STIL兔多克隆抗體(貨號：ab222838)，購自英國Abcam公司，工作濃度為1 ∶500。染色結(jié)果判讀：結(jié)果采用盲法測定，每張切片均由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行獨立判斷，參照之前的判讀方法[7]，根據(jù)染色強(qiáng)度(staining intensity，SI)乘以染色陽性細(xì)胞數(shù)(percentage of positive cells，PP)的百分比計算免疫反應(yīng)性評分(IRS)，詳細(xì)評分標(biāo)準(zhǔn)如下：SI(0～3分)：0為陰性，1例為弱陽性，2例為中度陽性，3例為強(qiáng)陽性；PP(0～4分)：0為陰性，1為1%～25%，2為26%～50%，3為51%～75%，4為76%～100%。IRS評分范圍為0～12分，若IRS> 4分，則計為STIL高表達(dá)；若IRS≤4分，則定義為STIL低表達(dá)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。公共數(shù)據(jù)庫Oncomine和TCGA下載的肝癌與正常組織數(shù)據(jù)之間的對比采用兩獨立樣本t檢驗。率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，Kaplan-Meier法(log-rank test)進(jìn)行單因素生存分析，而后將在單因素生存分析有意義的因素代入進(jìn)行Cox多因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肝癌及癌旁組織中STIL的表達(dá)水平Oncomine數(shù)據(jù)庫共檢索到4項有關(guān)“肝細(xì)胞癌vs正常肝組織”的研究涉及到有STIL基因mRNA表達(dá)水平的信息(圖1)，結(jié)果均顯示：與正常肝組織相比，STIL基因mRNA在肝癌中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。隨后，為驗證上述預(yù)測結(jié)果，采用免疫組化法對67例肝癌和癌旁配對組織進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：STIL蛋白主要表達(dá)于肝癌細(xì)胞質(zhì)中(圖2A)，其在肝癌中高表達(dá)陽性率為65.7%，而在配對癌旁正常組織中多為低表達(dá)(圖2B)，高表達(dá)陽性率僅為37.3%，兩組的表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.786，P=0.001)，見表1。這一蛋白表達(dá)結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫預(yù)測的mRNA表達(dá)結(jié)果相一致。

圖1　Oncomine數(shù)據(jù)庫預(yù)測STIL基因在肝癌中高表達(dá)

A: Roessler Liver(GEO：GSE14520)；B：Mas Liver(GEO：GSE14323)；C：Roessler Liver 2(GEO：GSE14520)；D：Wurmbach Liver(GEO：GSE6764)

圖2　STIL基因在肝癌及癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)水平(bar=50 μm)

2.2肝癌中STIL的差異表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系隨后，對肝癌中STIL差異表達(dá)水平與患者的各項臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行檢測顯示(表2)：STIL的不同表達(dá)水平(高表達(dá)vs低表達(dá))與患者的年齡(≤60歲vs> 60歲)、性別(男性vs女性)、Edmondson分級(Ⅰ～Ⅱ級vsⅢ～Ⅳ級)、腫瘤大小(≤ 5 cmvs>5 cm)、脈管侵犯(有vs無)及肝硬化(有vs無)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而僅與TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期vsⅢ～Ⅳ期)有關(guān)(P=0.006)。

4.創(chuàng)新活動載體。要提高黨組織的凝聚力和戰(zhàn)斗力，創(chuàng)新活動載體、保證活動成效十分關(guān)鍵。結(jié)合社會組織主要分布在油田各行各業(yè)、在職黨員具有較強(qiáng)的業(yè)務(wù)知識等特點，引導(dǎo)社會組織“適時、適宜、適度”地參與油田各項建設(shè)，引導(dǎo)他們參與油田的各項便民利民服務(wù)，如定期不定期舉辦法律、醫(yī)療保健，家庭理財?shù)确矫娴淖稍兎?wù)等，并通過建立服務(wù)志愿者隊伍，把參與結(jié)果作為吸收入黨、評選先進(jìn)的一項重要參考指標(biāo)，吸引更多的新社會組織從業(yè)人員投入到油田發(fā)展，使越來越多的員工群眾從中受益。

表1　STIL在肝癌及配對癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平[n(%)]

表2　STIL差異表達(dá)水平與肝癌患者各臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

a表示采用Fisher精確概率法，其余應(yīng)用χ2檢驗

2.3肝癌中STIL的表達(dá)預(yù)測患者預(yù)后的價值對STIL基因差異表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探索。TCGA數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果顯示：STIL基因mRNA水平高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后顯著差于其低表達(dá)患者(圖3A，P=0.003)。為驗證這一結(jié)果，隨后對免疫組化檢測的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析顯示：與之相似，STIL基因蛋白高表達(dá)的肝癌患者的生存時間顯著低于其低表達(dá)者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B，P<0.001)；Kaplan-Meier單因素生存分析顯示：STIL表達(dá)水平(高表達(dá)vs低表達(dá))、脈管侵犯(有vs無)以及TNM分期(Ⅰ-Ⅱ期vsⅢ-Ⅳ期)是影響肝癌患者生存時間差異的顯著因素(表3)；而將這3個有意義的單因素代入Cox多因素生存分析中顯示：STIL表達(dá)水平以及TNM分期可作為肝癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子(P<0.001，P=0.001)，見表4。

3　討論

肝癌在我國屬于較常見高發(fā)的惡性消化道腫瘤，具有富血管性、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點，其常見治療手段包括肝切除術(shù)、肝移植、TACE介入治療等，但對傳統(tǒng)的化療藥物不敏感，患者一般預(yù)后較差。因此，進(jìn)一步探索及開發(fā)有價值的生物標(biāo)志物來預(yù)測療效或成為靶向治療的有效藥物顯得尤為必要和迫切。STIL基因?qū)儆谥行牧?fù)制相關(guān)因子，源于與人類急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)染色體重排克隆，近期有研究[8-9]表明其可通過調(diào)節(jié)中心體結(jié)構(gòu)與數(shù)目，影響染色體不穩(wěn)定性形成，參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但STIL基因在肝癌中的表達(dá)情況及其是否對肝癌患者的預(yù)后有預(yù)測價值尚不清楚。

表3　肝癌患者的Kaplan-Meier單因素生存分析

表4　肝癌患者的Cox多因素生存分析

因此在本實驗中，首先運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，在Oncomine公共數(shù)據(jù)庫預(yù)測到STIL基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.05)；然后，采用免疫組化的方法對收集的67例肝癌及配對的癌旁組織進(jìn)行檢測顯示：與正常肝組織相比，STIL蛋白在肝癌組織中顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。這一真實數(shù)據(jù)結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果相一致。事實上，STIL基因在已報道的多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，如肺癌[4]、結(jié)腸癌[9]、胰腺癌[6]及胃癌[10]。這些結(jié)果也一定程度上提示：STIL基因在惡性腫瘤中可能扮演著促癌基因的角色參與著腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)進(jìn)程。

圖3　基于STIL差異表達(dá)水平應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制的總生存曲線

A：基于TCGA數(shù)據(jù)庫預(yù)測的STIL基因mRNA水平與總生存期曲線；B：基于真實數(shù)據(jù)STIL基因蛋白水平與總生存曲線

隨后，又對STIL基因表達(dá)水平與肝癌患者的臨床預(yù)后意義進(jìn)行了探索。首先相關(guān)性分析顯示：STIL的差異表達(dá)與肝癌患者的TNM分期有關(guān)；隨后運(yùn)用Kaplan-Meier單因素生存分析(log-rank test法)顯示：STIL高與低的差異表達(dá)水平、有無脈管侵犯以及TNM不同分期的肝癌患者其生存時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而將這3個有意義的單因素代入Cox多因素生存分析顯示：STIL高表達(dá)以及TNM分期(Ⅲ-Ⅳ)是可作為預(yù)測肝癌患者預(yù)后不佳的獨立預(yù)測因子。這一結(jié)果與利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)預(yù)測結(jié)果相一致。而在其它惡性腫瘤中，研究者們也發(fā)現(xiàn)與之類似的現(xiàn)象：STIL基因高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長、侵襲轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果提示：STIL基因高表達(dá)預(yù)示著肝癌患者預(yù)后不佳，該基因可能是參與肝癌生長、轉(zhuǎn)移等過程的關(guān)鍵靶點基因，但其詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。

綜上，本研究結(jié)果證實STIL基因在肝癌中高表達(dá)，且高表達(dá)的STIL可以作為預(yù)測肝癌患者預(yù)后不佳的獨立預(yù)測因子。未來STIL基因有望成為肝癌患者治療的新靶點。

參考文獻(xiàn)