JAK2、CALR及MPL基因突變檢測(cè)對(duì)BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤的診斷價(jià)值

楊　艷，熊術(shù)道，陶千山，王極宇，劉　軍，李曼曼，翟志敏

骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms, MPNs),也稱慢性骨髓增殖性疾病(chronic myeloproliferative diseases,CMPDs)，指分化相對(duì)成熟的一系或多系骨髓細(xì)胞惡性增殖所致的一組造血系統(tǒng)腫瘤性疾病，各病癥之間可共存或相互轉(zhuǎn)化，最終進(jìn)展為骨髓衰竭或轉(zhuǎn)化為急性白血病[1-2]。2001年WHO分類將CMPDs分為四種經(jīng)典疾病,即BCR-ABL陽(yáng)性慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發(fā)性血小板增多癥(essential thombocytosis，ET)、原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)及其它非經(jīng)典疾病，包括慢性中性粒細(xì)胞白血病(chronic neutrophilic leukemia，CNL)、慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病/高嗜酸性粒細(xì)胞綜合征(chronic eosinophilic leukemia/hypereosinophilic syndrome,CEL/HES)、不能分類的骨髓增殖性疾病(CMPD- unclassifiable, CMPD-U)[1]。隨著分子生物學(xué)的不斷研究，2008年WHO分型即根據(jù)疾病的腫瘤性特征，將其更名為MPNs，并包含肥大細(xì)胞增生癥(mastocytosis)，而CEL/HES則重新分為三大類, 即慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病-非特指型(CEL not otherwise specified, CEL-NOS)、HES和伴有嗜酸細(xì)胞增多和PDGFRA、PDGFRB和FGFR1異常的髓系或淋系腫瘤,前兩類仍屬于MPNs,而第三種則劃分為髓系腫瘤的一種新亞型[2]。MPNs以中老年人常見,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3-4]，因而需高度重視、及早診治。臨床上一直亟待找到像BCR-ABL融合基因這樣敏感性強(qiáng)、特異性高的分子標(biāo)志物來(lái)協(xié)助診斷BCR-ABL陰性MPN。直到2005年JAK2 V617F突變被在PV患者中首先發(fā)現(xiàn)[5]，接著JAK2基因12號(hào)外顯子、MPL及CALR等突變也在BCR-ABL陰性MPN中被相繼發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有研究[6]顯示這四種突變基因在BCR-ABL陰性MPN的臨床診斷等方面有重要作用。該研究旨在探討這幾種突變基因在BCR-ABL陰性MPN臨床診斷的運(yùn)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1病例資料收集2013年1月～2017年8月于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的345例外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)異常且臨床表現(xiàn)疑似MPNs患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 年齡小于18歲；② 沒法獲取組織病理學(xué)診斷結(jié)果；③ 未將這四種突變基因均檢測(cè)的；④ 精神障礙者。

符合入組條件者171例，其中符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)最終確診的106例BCR-ABL陰性MPN患者作為病例組：包括經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN 101例、MPN-U 4例、IHES 1例，其中10例骨髓病理檢查結(jié)果不符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)合其他診斷條件最終仍確診為MPN；65例非BCR-ABL陰性MPN患者作為對(duì)照組：BCR-ABL陽(yáng)性CML 19例；非MPN患者53例，其中骨髓增生異常綜合征5例、骨髓增生異常綜合征/骨髓增殖性腫瘤10例、急性髓系白血病1例、缺鐵性貧血4例、再生障礙性貧血1例、巨幼細(xì)胞性貧血1例、繼發(fā)性骨髓纖維化2例、其他血液系統(tǒng)惡性疾病繼發(fā)的血細(xì)胞增多2例；非血液系統(tǒng)惡性腫瘤2例、感染、炎癥及免疫性等相關(guān)的血細(xì)胞增多癥18例。所有病例符合2001年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書。

1.2主要儀器和試劑實(shí)時(shí)定量PCR儀(西安天隆科技有限公司，TL988)；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；骨髓增殖性腫瘤相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針法)(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)；PremixTaqTM(日本TaKaRa公司，TaqTMVersion2.0plusdye)；引物和探針由上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司合成。

1.3基因組DNA提取及基因檢測(cè)

1.3.1基因組DNA提取取患者骨髓2 ml，EDTA-K2抗凝,使用DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，具體操作參照說(shuō)明書。

1.3.2基因檢測(cè)使用qRT-PCR(Taqman探針法) 檢測(cè)JAK2 V617F、JAK2 12號(hào)外顯子、MPL及CALR突變。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μl，擴(kuò)增條件: 預(yù)變性42 ℃ 5 min, 變性94 ℃ 3 min ;退火94 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min，50個(gè)循環(huán);延伸25 ℃ 5 min,在60 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，擴(kuò)增結(jié)束后直接使用實(shí)時(shí)定量PCR儀分析軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1病例組與對(duì)照組臨床特征最終入組患者171例，其中病例組106例，選擇同期年齡、性別比例相匹配的65例患者設(shè)為對(duì)照組。研究結(jié)果顯示，JAK2 V617F及CALR突變陽(yáng)性率在兩組中有顯著性差異(P<0.01)，提示這兩種基因突變檢測(cè)對(duì)于鑒別BCR-ABL陰性MPN有一定特異性。最終入組患者中MPL突變僅檢出3例，故其發(fā)生率及臨床意義仍需進(jìn)一步探討，而本研究未檢測(cè)到JAK2 12號(hào)外顯子突變。見表 1。

表1　病例組與對(duì)照組臨床特征

2.2單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)JAK2V617F、MPL及CALR突變?cè)贐CR-ABL陰性MPN診斷中的價(jià)值研究顯示，JAK2 V617F突變與MPL和CALR突變相比，診斷BCR-ABL陰性MPN的靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、約登指數(shù)、診斷符合率均最高，Kappa檢驗(yàn)顯示Kappa=0.590，提示JAK2 V617F突變?cè)谠\斷上與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)一致性和準(zhǔn)確度最高，但其特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值稍低。CALR與JAK2 V617F及MPL突變相比，特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值最高，提示應(yīng)用CALR突變誤診率最低。當(dāng)3種突變基因聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值分別進(jìn)一步提高至84.9%、79.2%，且符合率升高(88.3%)，Kappa檢測(cè)Kappa=0.76，提示與金標(biāo)準(zhǔn)有較強(qiáng)的一致性，同時(shí)可保持一定特異度(93.9%)。見表2。

2.3101例經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN患者臨床特征為進(jìn)一步驗(yàn)證JAK2 V617F、MPL及CALR突變?cè)贐CR-ABL陰性MPN患者的臨床意義，選取PV、ET、PMF 3組患者分別比較基因突變、骨髓病理的診斷結(jié)果與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的符合率情況。由于MPN-U及IHES病例數(shù)少暫不予進(jìn)一步分析。見表3。

2.4101例經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN患者JAK2、MPL、CALR3種突變基因聯(lián)合檢測(cè)和骨髓病理診斷與WHO診斷符合率比較在對(duì)疾病診斷的準(zhǔn)確性判斷方面，以WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果為參考，基因突變?cè)\斷總的符合率為85.1%，其中PV組患者的符合率最高為96.0% ( 24/25 );其次是ET組患者83.6% ( 51/61 );PMF組患者符合率稍低為73.3% ( 11/15)。單獨(dú)骨髓病理診斷總符合率為90.1%，其中以PMF組最高為100%，其次是ET組(90.2%)、PV組(84.0%)?；蛲蛔?、骨髓病理診斷分別與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的符合率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示兩種診斷方法準(zhǔn)確性高度一致。見表4。

2.5101例經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN患者JAK2、MPL、CALR3種突變基因聯(lián)合檢測(cè)、骨髓病理之間診斷一致符合率比較基因突變、骨髓病理診斷分別與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的符合率比較大致相同，故為進(jìn)一步驗(yàn)證這兩種方法診斷價(jià)值，再次比較了基因診斷與骨髓病理診斷之間的符合度情況。結(jié)果兩種方法對(duì)101例BCR-ABL患者診斷結(jié)果相同共76對(duì)，診斷符合率為75.2%。其中PV組兩種方法診斷一致的符合率最高為80.0% ;其次是ET組為73.8%; PMF組符合率最低為73.3%。提示兩種方法對(duì)診斷經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

3　討論

表2　病例組與對(duì)照組基因突變陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果

表3　101例經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN患者臨床特征

表4　101例經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN患者JAK2、MPL、CALR3種基因突變聯(lián)合檢測(cè)和骨髓病理診斷符合率分析[n(%)]

從本研究中可以得出，BCR-ABL陰性MPN患者60%以上為老年人，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果大致相仿，本研究患者主要以ET為主，其次為PV，PMF、MPN-U、IHES患者較少，JAK2 V617F突變陽(yáng)性率在PV、ET、PMF分別為96.0%、62.3%、46.7%，MPL和CALR突變?cè)贓T、PMF中陽(yáng)性率分別為1.6%、6.7%和19.7%、20.0%，在BCR-ABL陽(yáng)性CML患者及其他非MPN患者中，共檢測(cè)出3例JAK2 V617F突變、1例MPL突變，未檢測(cè)到CALR突變，與國(guó)內(nèi)外研究[13-17]結(jié)果相仿。而本組4例MPN-U均檢出JAK2 V617F突變，與Singdong et al[15]研究相一致，但仍高于部分國(guó)內(nèi)外研究水平[16-17]，考慮原因?yàn)椴±龜?shù)較少、隨訪時(shí)間短，故其發(fā)生率及臨床意義仍需進(jìn)一步探討。以上研究結(jié)果揭示BCR-ABL陰性MPN患者JAK2 V617F、CALR基因突變陽(yáng)性率與引起血細(xì)胞增多的其他血液系統(tǒng)疾病或非血液系統(tǒng)疾病有顯著性差異，可以作為篩查BCR-ABL陰性的MPN患者的重要指標(biāo)。因此為證實(shí)基因突變?cè)\斷價(jià)值，本研究對(duì)這幾種基因診斷的真實(shí)性及可靠性做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，相比于單獨(dú)檢測(cè)，當(dāng)聯(lián)合檢測(cè)這3種突變時(shí)，靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值分別進(jìn)一步提高，同時(shí)可以保持一定的特異度，且聯(lián)合檢測(cè)與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的符合率最高，Kappa檢測(cè)Kappa=0.76，提示與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)有較強(qiáng)的一致性。因此基因突變檢測(cè)有助于早期臨床識(shí)別本病，提高診斷率，降低誤診及漏診率，從而及時(shí)干預(yù)，減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者生活質(zhì)量。

另外對(duì)于MPNs，骨髓病理有很大的診斷及鑒別診斷價(jià)值，因此以WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷結(jié)果為參考，比較在經(jīng)典的BCR-ABL陰性MPN患者中，單獨(dú)使用基因突變?cè)\斷和單獨(dú)骨髓病理診斷結(jié)果與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)的診斷結(jié)果一致的符合率情況，結(jié)果顯示兩種方法比較診斷符合率無(wú)顯著差異，提示兩者與WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷的準(zhǔn)確性高度一致。接著本研究繼續(xù)比較了基因診斷與骨髓病理診斷結(jié)果一致的符合率情況，從而進(jìn)一步驗(yàn)證基因突變檢測(cè)的臨床診斷意義。結(jié)果顯示，兩種方法診斷一致符合率為75.2% (P>0.05)，仍提示兩種方法準(zhǔn)確性高度一致。但兩種方法各有缺點(diǎn)很難互相替代，骨髓病理判斷可能存在人為的主觀臆斷，部分早期患者骨髓病理表現(xiàn)不典型；而JAK2 V617F、CALR、MPL突變難以明確判斷MPNs具體亞型，故臨床需兩種方法協(xié)助診斷，可能會(huì)使臨床診斷、早期治療干預(yù)、預(yù)防并發(fā)癥、改善預(yù)后等方面取得更大獲益。如今，隨著高通量技術(shù)的廣泛應(yīng)用，已有更多基因突變類型在MPNs中被檢測(cè)到[8]，期待未來(lái)能發(fā)現(xiàn)如BCR-ABL融合基因一樣對(duì)疾病具體亞型有高度特異性的分子標(biāo)志。

本研究仍存有一定局限性:① 雖然納入345例患者，但最終符合入組條件者僅171例，且僅4例MPN-U、1例IHES，也無(wú)其他MPN亞型，需要繼續(xù)隨訪及補(bǔ)充;② 本研究的樣本均來(lái)自本院，缺乏多中心數(shù)據(jù)，后續(xù)還需要聯(lián)合多中心研究、擴(kuò)大樣本量繼續(xù)驗(yàn)證此研究結(jié)論。

通過(guò)以上的整改措施，醫(yī)保投訴管理得到了完善和加強(qiáng)，降低了患者醫(yī)保相關(guān)投訴發(fā)生率，達(dá)到了預(yù)期效果，提高了患者的信任度和滿意度。在落實(shí)措施同時(shí)，派工作人員分別到接待中心輪轉(zhuǎn)，體驗(yàn)患者感受，體會(huì)患者需求，促使工作人員對(duì)患者投訴的重視程度進(jìn)一步提高。

參考文獻(xiàn)