基于FRET技術(shù)構(gòu)建破傷風(fēng)毒素和B型肉毒毒素酶類抑制劑高通量體外篩選方法

羅　森，丁朋曉，李　濤，王　琴，王　慧

破傷風(fēng)毒素(Tetanus toxin，Tet)導(dǎo)致的破傷風(fēng)死亡率高，在全球范圍內(nèi)高達(dá)30%～50%[1]。B型肉毒毒素(Botulinum Neurotoxin serotype B，BoNT/B)導(dǎo)致的B型肉毒食物中毒在全世界時(shí)有散發(fā)[2]。兩個(gè)毒素都為分子量150 ku的蛋白質(zhì)，由一條輕鏈(light chain，Lc)和一條重鏈(heavy chain，Hc)通過(guò)二硫鍵聯(lián)結(jié)在一起[3]。當(dāng)全毒素進(jìn)入血液后，Hc結(jié)合并進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)釋放出Lc[4]，兩個(gè)毒素的作用神經(jīng)蛋白位點(diǎn)相同，都特異性裂解VAMP-2的Q76 -F77位點(diǎn)[5]，阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，引起神經(jīng)傳導(dǎo)受阻導(dǎo)致人畜中毒死亡。目前，除抗體早期能夠中和血液中游離的毒素外，尚缺乏破傷風(fēng)毒素和肉毒毒素有效的治療方法和藥物。亟需開(kāi)發(fā)新型安全有效的藥物，大量潛在藥物的篩選需要合適理想的篩選模型。傳統(tǒng)的方法是動(dòng)物篩選模型，對(duì)大規(guī)?；虼笈康臉悠泛Y選和分析顯然不現(xiàn)實(shí)。FRET技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域研究中，該研究擬用底物肽(VAMP33-94)片段作為連接鏈(lingker)連接CFP 和 YFP兩個(gè)熒光蛋白構(gòu)建成底物。加入毒素后酶解linker導(dǎo)致兩個(gè)熒光分子分離距離較遠(yuǎn)而不會(huì)發(fā)生FRET，進(jìn)而YFP 發(fā)射528熒光值大大減弱和CFP發(fā)射485熒光值大大增強(qiáng)?；诖嗽?，建立以雙熒光標(biāo)記的底物分析法滿足對(duì)破傷風(fēng)毒素和B型肉毒毒素的檢測(cè)及抑制劑的高通量體外篩選所需 。

1　材料與方法

1.1材料重組蛋白B型肉毒毒素輕鏈(Botulinum Neurotoxin serotype B light chain, BLc)、重組蛋白破傷風(fēng)毒素輕鏈(Tetanus toxin light chain, TLc)、底物肽(VAMP33-94)片段及重組質(zhì)粒pET22b-CFP-YFP由本室前期制備和保存；FluoroNunc96孔黑板為丹麥Nunc公司產(chǎn)品。熒光檢測(cè)和分析通過(guò)SynergyTMHT 酶聯(lián)儀(美國(guó)BioTek公司)完成；反應(yīng)液為50 mmol/L Hepes液： pH 7.5，5 mmol/L DTT，10 μmol/L ZnCl2，10 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20。SDS、Amp、X-gal、IPTG購(gòu)自美國(guó)promega公司；酵母提取物和蛋白胨等培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXIOD公司；瓊脂糖、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切和酶T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司； DNA凝膠回收試劑盒、E.coliDH5α、BL21(DE3) Rosetta感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1載體、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物和D2 000 bp Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或超級(jí)純。HisTrap FF柱為GE Healthcare公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1表達(dá)載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過(guò)程設(shè)計(jì)原理：在pET22b表達(dá)載體中利用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)插入CFP基因片段和YFP基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒并命名pET22b-CFP-YFP，見(jiàn)圖1。在該重組質(zhì)粒通過(guò)BamHⅠ酶切位點(diǎn)位置插入其底物肽(VAMP33-94)片段。

圖1　pET22b-CFP-YFP質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

底物肽(VAMP33-94)片段與克隆載體pEASY-T1連接并立即轉(zhuǎn)化入制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。培養(yǎng)細(xì)菌涂平板，挑取單克隆試管培養(yǎng)后PCR鑒定，陽(yáng)性克隆菌送測(cè)序。測(cè)序正確的單克隆提取質(zhì)粒，保存克隆質(zhì)粒備用。用BamHⅠ37 ℃下過(guò)夜酶切重組克隆質(zhì)粒后DNA凝膠電泳分離并回收，同樣方法，用BamHⅠ酶切并回收的pET22b-CFP-YFP載體片段。使用T4 DNA連接酶連接底物肽(VAMP33-94)片段到pET22b-CFP-YFP載體中。連接后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，培養(yǎng)細(xì)菌涂平板，挑取單克隆培養(yǎng)后PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送測(cè)序并序列比對(duì)，提取序列比對(duì)完全一致的質(zhì)?？寺【辏４?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3) Rosetta中，培養(yǎng)后涂平板，挑取單克隆PCR鑒定，將陽(yáng)性菌落保存?zhèn)溆?。表達(dá)菌接種于含氨芐的10 ml培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，以1 ∶100接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至波長(zhǎng)600 nm處吸光度值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，在20 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。收集菌體6 000 r/min離心15 min后保存?zhèn)溆?。PBS重懸菌體，在冰水中進(jìn)行超聲充分破碎， 10 000 r/min離心15 min，收集上清液和沉淀15%SDS-PAGE分析目的蛋白情況。

超聲充分破碎處理細(xì)菌后以4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄沉淀收集上清備用，用結(jié)合緩沖液10個(gè)柱體積柱床體積的平衡鎳柱，取上清使用鎳柱(HisTrap FF柱)上樣進(jìn)行His親和層析純化，用10個(gè)柱體積洗脫緩沖液 (20 mmol/L 磷酸鈉，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4)線性梯度洗脫。收集洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。純化后的目的蛋白透析于緩沖液(50 mmol/L HEPES， pH 7.5)中保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3利用BLc和TLc分別對(duì)熒光標(biāo)記底物進(jìn)行活性鑒定在反應(yīng)緩沖液中，將ALc、BLc和TLc分別與熒光標(biāo)記底物在37 ℃反應(yīng)20 min，同時(shí)在設(shè)定陰性對(duì)照組中只加反應(yīng)緩沖液。對(duì)反應(yīng)后的樣品進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)底物的酶切情況。

1.2.4基于熒光標(biāo)記底物的分析方法的條件優(yōu)化利用Lc對(duì)熒光標(biāo)記底物活性的檢測(cè)指標(biāo)的確定和反應(yīng)條件的優(yōu)化步驟：① 根據(jù)以往研究報(bào)道顯示CFP熒光蛋白的激發(fā)波長(zhǎng)在434 nm左右，CFP熒光蛋白最強(qiáng)的熒光波長(zhǎng)在470 nm左右，本研究檢測(cè)值為485 nm；YFP熒光蛋白最強(qiáng)熒光波長(zhǎng)在527 nm左右，本研究檢測(cè)值為528 nm。在酶標(biāo)儀中裝入激發(fā)波(420/50)濾光片，發(fā)射波的分別為濾光片(485/20)和濾光片(528/20)；② 于96孔板中加入100 μl的系列濃度的熒光標(biāo)記底物，37 ℃條件下，于酶聯(lián)儀中動(dòng)態(tài)檢測(cè)熒光標(biāo)記底物發(fā)射波長(zhǎng)485 nm和528 nm的熒光值變化和發(fā)射波長(zhǎng)比 (528/485)變化；③ 在相同條件下對(duì)比加入BLc (或TLc)對(duì)熒光標(biāo)記底物反應(yīng)下熒光值485 nm和熒光值528 nm的變化以及熒光值比(528/485)的變化標(biāo)準(zhǔn)化后與底物變化蛋白電泳結(jié)果作相關(guān)性分析。在96孔板100 μl反應(yīng)體系中加入含有相應(yīng)濃度為的底物，處理孔加入TLc (或BLc)，對(duì)照組加入ALc，未處理孔只加反應(yīng)液，本底孔只有反應(yīng)液。處理好后立即用檢測(cè)酶標(biāo)儀。檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)通過(guò)Gen5軟件(BioTek) 處理和分析；④ 對(duì)分析方法的幾個(gè)參數(shù)檢測(cè)及優(yōu)化：底物從0.01 μmol/L 到100 μmol/L；酶從0.1 nmol/L到100 nmol/L；間隔時(shí)間從0.5 min到10 min；檢測(cè)時(shí)間從20 min到180 min。

1.2.5酶活動(dòng)力學(xué)測(cè)定在特定濃度下的Lc和系列梯度(300 nmol/L～33 μmol/L)底物對(duì)Km和Kcat進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)未434 nm，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)分別為485 nm和528 nm，至少動(dòng)態(tài)檢測(cè)30 min(2 min/次)。方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]和米氏方程。

2　結(jié)果

2.1重組表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果通過(guò)擴(kuò)增后獲得VMAP33-94底物片段，片段大小與預(yù)測(cè)結(jié)果大小相符。獲得的產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確，無(wú)堿基突變。VMAP33-94片段PCR回收產(chǎn)物在T4 DNA連接酶作用下連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化到克隆菌后挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果正確。提取克隆質(zhì)粒經(jīng)酶切處理得到目的插入片段，連接到表達(dá)載體pET22b-CFP-YFP并轉(zhuǎn)化克隆菌，PCR鑒定得到與條帶大小一致，測(cè)序結(jié)果表明與設(shè)計(jì)的完全一致，質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET-22b-CYVAMP。

2.2重組蛋白表達(dá)與純化結(jié)果質(zhì)粒pET-22b-CYVAMP轉(zhuǎn)入表達(dá)菌后培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后蛋白電泳分析顯示，誘導(dǎo)菌有明顯蛋白表達(dá)，與預(yù)期條帶大小一致，未誘導(dǎo)對(duì)照組未見(jiàn)目的條帶，見(jiàn)圖2A。超聲處理并純化后的重組蛋白，見(jiàn)圖2B，蛋白純度檢測(cè)約為90%。純化得到的雙熒光標(biāo)記底物蛋白命名為CYVAMP。

2.3ALc、BLc和TLc分別對(duì)CYVAMP進(jìn)行活性鑒定分析ALc、BLc和TLc對(duì)CYVAMP酶切鑒定，經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示：CYVAMP能被BLc和TLc分別酶解后產(chǎn)生與預(yù)期相符的兩條蛋白片段，而CYVAMP不能被ALc酶解，見(jiàn)圖3、4。

2.4基于熒光標(biāo)記底物的內(nèi)肽酶分析法檢測(cè)指標(biāo)的確定動(dòng)態(tài)檢測(cè)CFP、YFP和CYVAMP在528的熒光發(fā)射值與485的熒光發(fā)射值作圖結(jié)果表明：3個(gè)蛋白的528 nm和485 nm熒光值均隨檢測(cè)的時(shí)間進(jìn)程而逐漸減少，故單獨(dú)的某一熒光值作為檢測(cè)指標(biāo)無(wú)意義價(jià)值。但對(duì)比有無(wú)Lc酶作用于濃度為一定濃度(500 nmol/L ) CYVAMP時(shí)，將動(dòng)態(tài)收集的528 nm的熒光值與485 nm的熒光值進(jìn)行相比(即528/485)變化與時(shí)間作圖得出，只測(cè)CYVAMP其熒光值的比(528/485)在均值0.75上下波動(dòng)，比值較為穩(wěn)定，見(jiàn)圖5A。加入Lc酶組熒光值比(528/485)隨著酶切而逐漸減小。將相同條件下處理的樣品分別SDS-PAGE電泳分析作圖和動(dòng)態(tài)檢測(cè)熒光值比(528/485)標(biāo)準(zhǔn)化為底物量減少作圖，再利用線性回歸的最小二乘法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合得到兩者呈線性相關(guān)(R2=0.96)。

圖2　CYVAMP表達(dá)及純化SDS-PAGE分析

A.：CYVAMP表達(dá)結(jié)果圖；1：未誘導(dǎo)全菌蛋白上清液；2：誘導(dǎo)全菌蛋白上清液；箭頭標(biāo)記為目的蛋白CYVAMP條帶；B：CYVAMP純化后結(jié)果圖；1：純化后的CYVAMP結(jié)果；M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；箭頭標(biāo)記為目的蛋白條帶

圖3　SDS-PAGE分析TLc或ALc與CYVAMP蛋白的反應(yīng)結(jié)果

1：CYVAMP；2、3：CYVAMP+1 nmol/L TLc；4、5：CYVAMP+1 nmol/L ALc；M：Marker

圖4　SDS-PAGE分析ALc或BLc與CYVAMP蛋白的反應(yīng)結(jié)果

1：CYVAMP未處理對(duì)照；2：加入ALc；3、4：加入1 nmol/L BLc；5、6： 加入2 nmol/L BLc；7、8：加入10 nmol/L BLc；CYVAMP箭頭標(biāo)示為完整CYVAMP蛋白；M：Marker

圖5　對(duì)基于雙熒光標(biāo)記底物的內(nèi)肽酶分析法CYVAMP檢測(cè)的底物濃度和BLc濃度的條件優(yōu)化結(jié)果圖

A：通過(guò)對(duì)系列濃度(32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μmol/L)的CYB在濾光片靈敏度65時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖；B：通過(guò)檢測(cè)(1、2、4 nmol/L)濃度的BLc酶切32 μmol/L CYB時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖； C：通過(guò)檢測(cè)(1、2、4 nmol/L)濃度的BLc酶切8 μmol/L CYB時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖； D：通過(guò)檢測(cè)(1、2、4 nmol/L)濃度的BLc酶切1 μmol/L CYB時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖； E：通過(guò)檢測(cè)(1、2、4 nmol/L)濃度的BLc酶切125 nmol/L CYB時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖； F：通過(guò)檢測(cè)(1、2、4 nmol/L)濃度的BLc酶切62.5 nmol/L CYB時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)比率(528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖

2.5基于熒光標(biāo)價(jià)底物分析方法的條件優(yōu)化結(jié)果通過(guò)對(duì)倍梯度濃度的CYVAMP在濾光片的靈敏度設(shè)置為75時(shí)，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光值比(528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖，見(jiàn)圖5A，檢測(cè)結(jié)果顯示，CYVAMP濃度不能過(guò)低，過(guò)低(低于125 nmol/L時(shí))則熒光值比(528/485)隨時(shí)間檢測(cè)變化波動(dòng)較大。實(shí)時(shí)測(cè)定系列濃度(32～0.062 5 μmol/L)的CYVAMP 在(梯度濃度1、2、4 nmol/L) BLc作用下，熒光值比 (528/485)與檢測(cè)時(shí)間作圖，分別見(jiàn)圖5 B～F。以上作圖分析顯示CYVAMP在高濃度(約32 μmol/L)時(shí)雖然528/485比值較穩(wěn)定，但是在梯度濃度的BLc酶切后得不出明顯的量效關(guān)系，導(dǎo)致檢測(cè)分析不敏感。CYVAMP濃度在低于125 nmol/L時(shí)本身熒光值比(528/485)波動(dòng)較大，加之BLc酶切底物過(guò)快而來(lái)不及測(cè)定準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

對(duì)分析方法底物濃度和酶濃度的條件優(yōu)化后結(jié)果得到CYVAMP較適宜的范圍為0.2～32 μmol/L之間。當(dāng)CYVAMP底物濃度為300 nmol/L時(shí)， BLc在納摩爾濃度水平與熒光值比 (528/485)斜率隨時(shí)間變化呈現(xiàn)出量效關(guān)系，動(dòng)態(tài)檢測(cè)得到BLc在0～10 nmol/L系列濃度梯度，與熒光值比 (528/485) 曲線斜率之間呈正比關(guān)系，見(jiàn)圖6(圖中C2-比率、C3-比率、C4-比率、C5-比率、C6-比率、C7-比率分別對(duì)應(yīng)為0 nmol/L BLc、1 nmol/L BLc、2 nmol/L BLc、4 nmol/L BLc、8 nmol/L BLc、10 nmol/L BLc)。類似地對(duì)其他參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化得到：酶聯(lián)儀濾光片靈敏度設(shè)定的較合適的設(shè)置范圍在65～110之間；(對(duì)于96孔板)動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)間隔時(shí)間2 min較為合適；檢測(cè)持續(xù)時(shí)間從30 min到120 min較合適；CYVAMP在內(nèi)肽酶BLc作用下熒光值比(528/485)隨時(shí)時(shí)間變化作圖最大時(shí)在1.5左右，最小在0.5左右。針對(duì)TLc檢測(cè)結(jié)果大致相同。

2.6酶活動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定結(jié)果測(cè)定酶活動(dòng)力學(xué)參數(shù)得到：BLc 切割底物CYVAMP的值Kcat值為(4.16±0.28) s-1和Km為(17.6±2.6) μmol/L；類似地得到TLc 切割底物CYVAMP的Km和Kcat值分別為(40.8±3.5) μmol/L和(2.65±0.32) s-1。

3　討論

由于破傷風(fēng)毒素和肉毒毒素都是劇毒物質(zhì)，對(duì)其操作面臨潛在的健康危害甚至生命危險(xiǎn)[6]，且無(wú)法有效地使重鏈和輕鏈分離?；谝陨显?，且能夠安全經(jīng)濟(jì)和高效快速制備獲得毒素輕鏈，本研究利用基因重組表達(dá)獲得的輕鏈以代替全毒素用于體外篩選模型。

圖6　BLc梯度濃度與CYVAMP在濃度為300 nmol/L時(shí)動(dòng)態(tài)斜率的關(guān)系

破傷風(fēng)毒素和肉毒毒素的拮抗劑的研究開(kāi)發(fā)一直未取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展[7]，其中很重要的原因是缺乏高通量的檢測(cè)模型限制了研發(fā)進(jìn)程。傳統(tǒng)經(jīng)典的動(dòng)物模型對(duì)于大批量的樣品的篩選來(lái)說(shuō)顯然不現(xiàn)實(shí)，曾有國(guó)外學(xué)者基于短肽底物構(gòu)建HPLC[8]和MS[9]等篩選方法，但由于缺乏敏感性，或需要很多步驟才能完成分析檢測(cè)，或需要依賴昂貴的儀器設(shè)備等原因[10]限制了新型藥物的篩選和研究進(jìn)程。本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建并通過(guò)成熟的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備雙熒光標(biāo)記底物和毒素輕鏈，該制備方法簡(jiǎn)單方便且產(chǎn)率高，很容易就獲得所需關(guān)鍵試劑。該篩選方法的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在不需要犧牲大量的動(dòng)物，能夠提供實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)，不需要復(fù)雜的設(shè)備(如其他一些篩選方法需要MS或HPLC平臺(tái))，甚至對(duì)于分析人員來(lái)說(shuō)都不需要嚴(yán)格的訓(xùn)練就能夠完成篩選。該體外篩選技術(shù)還具有微量、快速、靈敏、省時(shí)又經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，可以短時(shí)間內(nèi)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試篩選。對(duì)同一樣品可以在破傷風(fēng)和B型肉毒毒素上同時(shí)篩選，將加快新藥發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。本課題組已初步用該模型篩選對(duì)一系列化合物針對(duì)破傷風(fēng)毒素和B型肉毒毒素[11]進(jìn)行篩選。該方法也可應(yīng)用于檢測(cè)大批量食品是否含有B型肉毒毒素污染。可以快速方便地對(duì)制備的破傷風(fēng)毒素制劑[12]和B型肉毒毒素制劑[13-14]的活性評(píng)估。同時(shí)，也為其他將以雙熒光標(biāo)記底物構(gòu)建體外高通量篩選模型的研究作為很好的參考[10]。