MeCP2增加LPS誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥因子分泌

鄭　松，王殿超，張　磊

甲基化CpG結(jié)合蛋白(methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)是一種甲基化調(diào)控蛋白，能夠特異性與甲基化DNA結(jié)合，形成復(fù)合物來(lái)抑制目的蛋白轉(zhuǎn)錄。眾多文獻(xiàn)[1-2]報(bào)道，MeCP2能夠通過(guò)調(diào)控甲基化水平參與細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等多種生理病理過(guò)程。研究[3]表明MeCP2可以通過(guò)PTCH1/GLIS1通路調(diào)控人急性單核細(xì)胞白血病單核細(xì)胞株分泌白介素(interleukin, IL)-6和腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor, TNF)-α的表達(dá)，但是MeCP2在炎癥性肺病中的作用未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)siRNA沉默等技術(shù)抑制MeCP2的表達(dá)，探討其對(duì)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(MH-S)分泌炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用，為炎癥性肺病提供基礎(chǔ)研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; Lipofectamine 2000 Reagent和TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；TransStart Tip Green qPCR Super Mix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液和胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司；MeCP2抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；p-p65、p65、p-IκBα和IκBα抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)器材MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自荷蘭雷勃公司；Bio-rad電泳儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppedorf公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1MH-S細(xì)胞培養(yǎng)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2和濕度飽和條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.2MeCP2-siRNA轉(zhuǎn)染到MH-S取對(duì)數(shù)期MH-S細(xì)胞，用含10%胎牛血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為(1.0～2.0)×105/ml接種于培養(yǎng)瓶；培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基后用PBS洗3次；16 μl的siRNA與8 μl LipofectamineTM2000分別用500 μl Opti-MEM稀釋,且孵育5 min后混合，室溫靜置20 min后加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)Opti-MEM到4 ml后常規(guī)培養(yǎng)，8 h后換成10%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后期實(shí)驗(yàn)。MeCP2-siRNA序列：5′-GCUUCCCGAUUAACUGAAA TT-3′; 5′-UUUCAGUUAAUCGGGAAGCTT- 3′。

1.3.3Q-PCR法檢測(cè)MeCP2 、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)采用TRIzol法提取MH-S細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)得到cDNA。根據(jù)TransStart Tip Green qPCR Super Mix說(shuō)明書(shū)混合MeCP2、IL-1β、IL-6和TNF-α引物和SYBR Green，使用Q-PCR儀檢測(cè)MeCP2、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1　基因引物序列

1.3.4Western blot法檢測(cè)MeCP2、p-p65、p65、p-IκBα和IκBα的蛋白表達(dá)取處理后的MH-S細(xì)胞，加入400 μl的RIPA(含100 mmol/L PMSF)細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min；4 ℃、12 000 r/min，離心30 min；取上清液加入SDS蛋白上樣緩沖液99.9 ℃變性10 min。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)移將蛋白與PVDF膜結(jié)合上，在5%脫脂牛奶中封閉3 h；TBST清洗3次，每次15 min；一抗4度孵育過(guò)夜后，TBST洗3次后二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后ECL發(fā)光試劑盒顯影。一抗?jié)舛葹椋篗eCP2 (1 ∶500)、p-p65 (1 ∶500)、p65 (1 ∶1 000)、p-IκBα (1 ∶500)和IκB (1 ∶1 000)；二抗?jié)舛染鶠? ∶10 000。用ImageJ軟件分析，以β-actin為內(nèi)參。

1.3.5ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)收集處理后的MH-S細(xì)胞上清液，3 000 r/min，離心20 min；取上清液于1.5 ml EP管內(nèi)保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白含量。

2　結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響使用不同濃度的LPS刺激MH-S后，如圖1所示，Q-PCR檢測(cè)顯示IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平隨著LPS濃度的增加而增加(F=36.89、18.34、21.77，P<0.01,P<0.05)；ELISA結(jié)果同樣表明MH-S細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平隨著LPS濃度的增加而增加(F=42.83、32.37、30.81，P<0.05)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取LPS濃度為1 000 ng/ml作為刺激MH-S濃度。

圖1　LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

A：LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞的IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)；B：LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)；1：0 ng/ml LPS；2：125 ng/ml LPS；3：250 ng/ml LPS；4：500 ng/ml LPS；5：1 000 ng/ml LPS；6：2 000 ng/ml LPS；與0 ng/ml LPS比較：#P<0.05,##P<0.01

2.2LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞對(duì)MeCP2表達(dá)的影響使用不同濃度的LPS刺激MH-S細(xì)胞后，如圖2所示，Q-PCR檢測(cè)顯示MeCP2 mRNA的表達(dá)水平隨著LPS濃度的增加而增加(F=19.28，P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示MeCP2蛋白水平同樣隨著LPS濃度的增加而增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.21，P<0.01)。提示MeCP2可能與MH-S細(xì)胞分泌炎癥因子有關(guān)。

2.3MeCP2-siRNA抑制LPS誘導(dǎo)MH-S對(duì)IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響為了研究MeCP2在MH-S細(xì)胞中的作用，使用MeCP2-siRNA沉默MH-S中MeCP2的表達(dá)，分組分別為Scrambled-RNAi組，LPS+Scrambled-RNAi和LPS+MeCP2-siRNA組，如圖3所示，MeCP2-siRNA顯著降低了MH-S細(xì)胞中的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.87、11.29，P<0.05)。同時(shí)使用Q-PCR和ELISA方法檢測(cè)顯示，IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA和分泌蛋白水平明顯下降(P<0.05)。提示抑制MeCP2表達(dá)能夠抑制LPS誘導(dǎo)MH-S分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)。

圖2　LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞對(duì)MeCP2表達(dá)的影響

A：LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞中MeCP2基因表達(dá)；B：LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞中MeCP2蛋白表達(dá)；1：0 ng/ml LPS；2：125 ng/ml LPS；3：250 ng/ml LPS；4：500 ng/ml LPS；5：1 000 ng/ml LPS；6：2 000 ng/ml LPS；與0 ng/ml LPS比較：##P<0.01

2.4MeCP2-siRNA抑制MH-S對(duì)p-p65和p-IκBα蛋白表達(dá)的影響為了研究MeCP2如何抑制MH-S分泌炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，分組分別為Scrambled-RNAi組，LPS+Scrambled-RNAi和LPS+MeCP2-siRNA組，使用Western blot檢測(cè)NF-κB通路顯示，p-p65和p-IκBα的蛋白表達(dá)顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。提示MeCP2有可能是通過(guò)抑制NF-κB通路，進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)MH-S分泌炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖3　MeCP2-siRNA抑制LPS誘導(dǎo)MH-S中IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響

A：MeCP2-siRNA抑制MH-S中MeCP2 mRNA表達(dá)；B：MeCP2-siRNA抑制MH-S中MeCP2蛋白表達(dá)；C：MeCP2-siRNA抑制LPS誘導(dǎo)MH-S中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)；D：MeCP2-siRNA抑制LPS誘導(dǎo)MH-S分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)；1：Scrambled-RNAi；2：LPS+ Scrambled-RNAi；3： LPS+MeCP2-siRNA；與Scrambled-RNAi比較：##P<0.01；與LPS+Scrambled-RNAi比較：*P<0.05，**P<0.01

圖4　MeCP2-siRNA抑制MH-S對(duì)p-p65和p-IκBα蛋白表達(dá)的影響

1：Scrambled-RNAi；2：LPS+Scrambled-RNAi；3： LPS+MeCP2-siRNA；與Scrambled-RNAi組比較：##P<0.01；與LPS+Scrambled-RNAi組比較：*P<0.05，**P<0.01

3　討論

炎癥性肺病是由于肺外各種致病因素導(dǎo)致肺及支氣管內(nèi)大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放大量炎癥介質(zhì)進(jìn)而引起肺內(nèi)炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失衡造成的肺臟疾病，如支氣管哮喘、急性肺損傷等[4-5]。因此進(jìn)一步研究炎癥性肺病的發(fā)病機(jī)制、尋找新的防治靶點(diǎn)仍然是研究的重點(diǎn)。肺泡巨噬細(xì)胞是肺內(nèi)固有的巨噬細(xì)胞[5]，能夠在異物刺激時(shí)分泌大量炎癥因子，在清除有害物質(zhì)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[6]表明，肺泡巨噬細(xì)胞受到LPS、干擾素-γ等刺激后，能夠分泌大量炎癥因子，如TNF-α、IL-6和IL-1β等，能夠直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性，引起水腫等。如何抑制肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥因子釋放成了治療和控制炎癥性肺部的關(guān)鍵。

本文研究顯示，小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S受到LPS刺激后，炎癥因子和MeCP2表達(dá)同時(shí)升高，說(shuō)明MeCP2可能與MH-S細(xì)胞分泌炎癥因子有關(guān)。同時(shí)研究[3]表明MeCP2能夠抑制肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α的表達(dá)，提示MeCP2與巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子有著密切關(guān)系。本文又通過(guò)siRNA沉默技術(shù)特異性沉默MeCP2表達(dá)后，Q-PCR和ELISA檢測(cè)顯示TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低，說(shuō)明可以通過(guò)抑制MeCP2的表達(dá)來(lái)降低肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥因子釋放。

外源性微生物產(chǎn)生的LPS為T(mén)oll樣受體4的外源性配體[7]，能夠激活NF-κB通路，促進(jìn)各種炎癥因子的表達(dá)。在靜息的細(xì)胞中，NF-κB與IκB形成復(fù)合物，以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中[8]。當(dāng)細(xì)胞受到刺激，IκB被磷酸化，暴露NF-κB的核定位點(diǎn)p65，p65被磷酸化后迅速進(jìn)入細(xì)胞核，從而引起一系列的炎癥因子分泌。NF-κB是具有廣泛調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子[9]，因此，NF-κB 信號(hào)通路是炎癥性肺病最受關(guān)注的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一。本文研究顯示抑制MeCP2后，p-p65和p-IκBα表達(dá)明顯降低，提示，MeCP2抑制MH-S細(xì)胞釋放炎癥因子，可能是通過(guò)抑制NF-κB的活化。

綜上所述，本研究結(jié)果首次證明MeCP2在MH-S細(xì)胞中具有重要作用，抑制MeCP2表達(dá)能夠抑制LPS刺激MH-S細(xì)胞分泌炎癥因子，可能是通過(guò)抑制NF-κB的活化，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。