CRAE對(duì)百草枯中毒大鼠肺纖維化的保護(hù)作用機(jī)制

郭啟芬，謝來柱，張　泓

隨著百草枯(paraquat)在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用，百草枯中毒事件越來越多，而百草枯中毒的患者往往會(huì)繼發(fā)性肺纖維化從而引起限制性肺通氣障礙?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺纖維化一種以肺間質(zhì)炎癥、纖維組織增生、胞外基質(zhì)代謝異常的彌漫性肺間質(zhì)疾病[1]。本病的平均生存期不高，且臨床上缺乏有效的治療手段。中醫(yī)治療肺部疾病已有數(shù)千年歷史，有豐富的經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。該課題組根據(jù)當(dāng)?shù)刂委煛胺渭病逼?，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)理論及西醫(yī)肺纖維化相關(guān)的基礎(chǔ)研究，使用現(xiàn)代水提法制備出復(fù)方赤芍黃芪提取物(compound of Radix Paeoniae Rubra and Astragalus extract,CRAE)，并觀察其對(duì)百草枯引起的肺纖維化等方面的療效。

1　材料與方法

1.1藥物制備復(fù)方赤芍黃芪提取物是根據(jù)當(dāng)?shù)刂委煛胺渭病逼胶蛦蝿┧幬锍煞中拚?，以赤芍、黃芪、鱉甲以及其他輔料按照(2 ∶2 ∶1 ∶1)配伍，使用現(xiàn)代水提法工藝制備而成。其主要成分有芍藥苷、芍藥內(nèi)脂苷、黃芪多糖、鱉甲多糖等。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β,TGF-β1) ELISA試劑盒、Ⅰ型纖溶酶原激活抑制因子 (plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1) ELISA試劑盒、金屬基質(zhì)蛋白酶9 (matrix metallopeptidase 9,MMP-9) ELISA試劑盒、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1 (tissue inhibitor of metallopeptidase 1,TIMP-1) ELISA試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)試劑盒、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)試劑盒、Ⅲ 型膠原蛋白(collagen protein type Ⅲ ,PC-Ⅲ )試劑盒、層粘連蛋白(laminin,LN)試劑盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α) ELISA試劑盒、白介素17(interleukin 17,IL-17) ELISA試劑盒、白介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA試劑盒、BCA法蛋白測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；P-Smad2、Smad2、P-Smad3、Smad3、Smad7、GAPDH、PAI-1一抗及二抗購自美國Sigma公司；qPCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；PAI-1引物購自上海生工生物公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用雄性SD大鼠90只，體重260 g左右，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)2008003。將動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫?zé)o菌動(dòng)物房中，隨機(jī)分成6組，每組15只，分別為正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組(潑尼松5.0 mg/kg)、CRAE 0.6 g/kg組、CRAE 1.2 g/kg組、CRAE 2.4 g/kg組。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模[2]將模型組、陽性對(duì)照組、CRAE 0.6 g/kg組、CRAE 1.2 g/kg組、CRAE 2.4 g/kg組大鼠稱重后按照0.1 ml/100 g百草枯藥液灌胃造模。造模結(jié)束24 h后，按照相應(yīng)給藥方式進(jìn)行灌胃處理，每天1次。造模后各組大鼠均出現(xiàn)呼吸變淺、呼吸頻率加快、呼吸困難等癥狀。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至4周時(shí)，有大鼠開始死亡，結(jié)束灌胃并處死大鼠。摘取大鼠肺臟稱重并計(jì)算肺臟臟器指數(shù)。肺臟臟器指數(shù)=肺臟重量/大鼠體重。腹主動(dòng)脈取血，以1 000 r/min離心20 min分離血清后置于-20 ℃冷凍備用。取大鼠肺臟并使用組織均漿機(jī)均漿組織液，置于-80 ℃冷凍備用。

1.5大鼠血清HA、PC-Ⅲ、LN含量和肺組織中MMP-9、TIMP-1、Hyp、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-17、IL-6、TGF-β1、PAI-1含量測(cè)定取出凍存的大鼠血清和組織液，按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量和肺組織中MMP-9、TIMP-1、Hyp、MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-17、IL-6、TGF-β1、PAI-1含量。

1.6Q-PCR法檢測(cè)PAI-1mRNA的含量使用TRIzol試劑盒提取大鼠組織液中的總RNA。使用qPCR試劑盒檢測(cè)各組PAI-1的mRNA含量。以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)。使用的qPCR引物見表1。

表1　PCR所用引物及其序列

1.7Westernblot法分析P-Smad2、Smad2、P-Smad3、Smad3、Smad7和PAI-1蛋白的含量將凍存的肺組織液與RIPA組織裂解液混合后，4 ℃冰上靜置30 min，4 ℃、13 000 r/min離心30 min，離心結(jié)束后取上清液。使用BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，按照Western blot法將蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜后置于4 ℃一抗雜交袋過夜，TBST清洗后，室溫孵育二抗2 h。使用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光并分析統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果

2.1CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠存活率、肺臟重量和肺臟臟器指數(shù)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的肺臟重量和肺臟臟器指數(shù)明顯升高(P<0.05)，存活率明顯降低；與模型組相比，陽性對(duì)照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺纖維化大鼠的肺臟重量和肺臟臟器指數(shù)，升高大鼠的存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.2CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對(duì)照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺纖維化大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中MDA、SOD和GSH-Px含量的影響與正常對(duì)照組相比，肺纖維化大鼠肺組織中MDA的含量明顯升高，SOD和GSH-Px的含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對(duì)照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組大鼠肺組織中MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px的含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2　CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠存活率、肺臟重量、肺臟臟器指數(shù)和血清中HA、PC-Ⅲ、LN含量的影響

與正常對(duì)照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

表3　CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)肺纖維化模型大鼠肺組織中MDA、SOD、GSH-Px、MMP-9、TIMP-1和Hyp含量的影響

與正常對(duì)照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

表4　CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)肺纖維化模型大鼠肺組織TNF-α、IL-17、IL-6 、TGF-β1和PAI-1的影響

與正常對(duì)照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

2.4CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1和Hyp含量的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中MMP-9的含量明顯降低，TIMP-1和Hyp含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對(duì)照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組大鼠肺組織中MMP-9的含量明顯升高，而TIMP-1和Hyp的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.5CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中TNF-α、IL-17和IL-6含量的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中TNF-α、IL-17和IL-6的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對(duì)照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組TNF-α、IL-17和IL-6的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.6CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1含量的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性對(duì)照組、CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組大鼠肺組織中TGF-β1和PAI-1的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.7CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中P-Smad2、P-Smad3和Smad7蛋白水平的影響與正常對(duì)照組相比，模型組肺纖維化大鼠肺組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Smad7蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組相比，CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組能明顯降低大鼠肺組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白水平，升高Smad7蛋白水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.8CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織中PAI-1及mRNA水平的影響與正常對(duì)照組相比，模型組肺纖維化模型大鼠肺組織中PAI-1蛋白及mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，CRAE 1.2 g/kg和CRAE 2.4 g/kg組肺纖維化大鼠肺組織中PAI-1蛋白及mRNA的水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3　討論

百草枯中毒后絕大部分集中在肺組織，引起肺泡損傷以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致肺泡內(nèi)及間質(zhì)纖維化，影響氣體交換，死亡率高，且存活者中大部分存在肺纖維化。因此，有效干預(yù)及減輕肺損傷及繼發(fā)肺纖維化可以減少百草枯中毒的病死率?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)關(guān)于肺纖維化研究顯示，許多細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-17、IL-6、PDGF、TGF-β，通過自分泌或旁分泌形式啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)，從而導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。其中，TGF-β1在肺纖維化病理過程中起重要作用。有研究[3]表明，TGF-β1基因表達(dá)廣泛表達(dá)于肺損傷至肺纖維化各個(gè)階段，在趨化巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子釋放，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生，增加胞外ECM沉積等方面均有重要的作用。在本研究中，CRAE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺臟重量和肺臟臟器指數(shù)，降低TGF-β1在肺組織中的含量，提示CRAE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組對(duì)肺纖維化有一定的療效。

圖1　CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化模型中大鼠肺組織中P-Smad2、P-Smad3和Smad7蛋白水平的影響

A：P-Smad2；B：P-Smad3；C：Smad7；1：正常對(duì)照組; 2：模型組; 3：CRAE 1.2 g/kg組; 4：CRAE 2.4 g/kg組；與正常對(duì)照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

圖2　CRAE對(duì)百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化模型中大鼠肺組織中PAI-1蛋白和mRNA水平的影響

1：正常對(duì)照組; 2：模型組; 3：CRAE 1.2 g/kg組; 4：CRAE 1.4 g/kg組；與正常對(duì)照組相比：*P<0.05；與模型組相比：#P<0.05

百草枯中毒后，機(jī)體產(chǎn)生活性氧自由基和活性氮自由基可導(dǎo)致生物大分子發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而引起細(xì)胞和組織損傷。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，是判斷細(xì)胞受損的重要標(biāo)志物。SOD和GSH-Px可清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，減輕和阻斷脂質(zhì)過氧化物對(duì)機(jī)體的損害，保護(hù)機(jī)體免受各類自由基的損害[4]。在本次實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的MDA顯著升高，而SOD和GSH-Px含量顯著下降，提示百草枯可引起大鼠產(chǎn)生自由基損害肺泡細(xì)胞，而CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以明顯降低肺組織中MDA含量，升高SOD和GSH-Px的水平，提示CARE可以保護(hù)肺臟對(duì)抗百草枯中毒引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。在肺纖維化發(fā)生的過程中，細(xì)胞外ECM降解與重塑失衡。MMP-9可以降解肺ECM和基底膜，并能調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子及細(xì)胞，從而抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，而TIMP-1可特異性抑制MMP-9的降解作用。MMP-9和TIMP-1作為影響ECM代謝的主要酶類，在肺纖維化過程中對(duì)ECM平衡起著關(guān)鍵作用[5]。HA、PC-Ⅲ、LN、Hyp等可反應(yīng)肺纖維化形成，膠原增生和肺臟纖維化程度，是肺纖維化活動(dòng)性的指標(biāo)[6]。在本次研究中，CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以升高模型大鼠肺組織中MMP-9的含量，抑制TIMP-1的水平，提示CARE可以調(diào)控肺纖維化的胞外ECM失衡；進(jìn)一步的， CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以降低模型大鼠肺組織中的HA、PC-Ⅲ、LN、Hyp含量，提示CARE可以抑制胞外ECM的堆積，抑制大鼠的肺纖維化的生成。

在肺纖維化的發(fā)生過程中，大量的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-17、IL-6等也發(fā)揮了重要的作用。TNF-α參與肺臟損傷，引起大量膠原合成和沉積，IL-17和IL-6是細(xì)胞炎性因子，介導(dǎo)肺臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺纖維化[7]。在不同結(jié)構(gòu)的TGF-β中，TGF-β1表達(dá)最久，作用最重要，其高低直接影響肺纖維化的程度。其信號(hào)主要是通過TGF-β跨膜受體(TGF-β receptor R,TGF-βR)及胞內(nèi)Smad信號(hào)通路介導(dǎo)。當(dāng)TGF-β1與TGF-βR結(jié)合后，可磷酸化胞內(nèi)的Smad2和Smad3蛋白，繼而與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物(P-Smad2/3/4)，轉(zhuǎn)位入核調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的表達(dá)。Smad7可與TGF- TGF-βRⅡ結(jié)合，抑制Smad2/3磷酸化，從而抑制TGF-β/Smad通路[8-9]。PAI-1是TGF-β1重要的靶基因，作為纖溶酶原激活物抑制劑，能通過抑制纖溶酶的生成，增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[10]。在本次實(shí)驗(yàn)中， CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組可以顯著降低模型大鼠肺組織中P-Smad2和P-Smad3蛋白水平，升高Smad7的水平；而且CARE 1.2 g/kg組和CRAE 2.4 g/kg組還可以升高PAI-1蛋白和mRNA水平。以上結(jié)果提示CARE可以通過抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2和Smad3的磷酸化水平，提高Smad7蛋白，降低PAI-1的表達(dá)，抑制肺纖維化的發(fā)生。

綜上所述，CARE對(duì)百草枯引起的肺纖維化有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad通路，上調(diào)Smad7表達(dá)，降低PAI-1表達(dá)等有關(guān)。