普萘洛爾影響血管瘤干細(xì)胞向脂肪分化的研究

王獻(xiàn)路，婁　寅，陳增紅，曹東升

嬰幼兒血管瘤(infantile hemangiomas, IHs)是嬰幼兒時(shí)期最常見的良性腫瘤，全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率高達(dá)4%～10%[1]。2008年，Léauté-Labrèze et al[2]發(fā)現(xiàn)普萘洛爾(Propranolol, PRN)可對IHs產(chǎn)生治療效果。時(shí)至今日，PRN已漸漸替代激素成為治療IHs的一線藥物。同樣在2008年，血管瘤干細(xì)胞(hemangioma stem cells, HemSCs)被Khan et al[3]首次報(bào)道，并在裸鼠上重建了獨(dú)特的IHs演變過程，提示HemSCs可能是IHs的來源細(xì)胞。近年來，關(guān)于PRN治療IHs的研究大多數(shù)是圍繞HemSCs開展的，取得了一些成果[4-5]，但是對于其治療機(jī)制尚無突破性進(jìn)展。IHs的自然發(fā)展最終是以纖維脂肪組織出現(xiàn)代替增生的血管組織為特征性表現(xiàn)的，臨床上也發(fā)現(xiàn)，使用PRN治療IHs數(shù)月后再次行手術(shù)切除的患兒，術(shù)中切除的瘤體組織表淺面呈現(xiàn)IHs特征性的鮮紅色圓形凸起，但深部會(huì)有大量脂肪組織存在，與消退階段出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞的特征相似，但時(shí)間進(jìn)程上卻大大提前。由此推測，PRN可能是通過影響HemSCs向脂肪細(xì)胞分化從而治療血管瘤的。該研究通過對HemSCs進(jìn)行體外提取與培養(yǎng)，檢測PRN干預(yù)HemSCs時(shí)脂化相關(guān)因子的變化，旨在為IHs的治療提供新的思路與方法。

1　材料與方法

1.1血管瘤標(biāo)本經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得患兒家屬同意并簽署知情同意書后，收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切取的未進(jìn)行任何治療的增殖期血管瘤新鮮標(biāo)本，共2例，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科確診為增殖期血管瘤。HemSCs的獲取依據(jù)Khan et al[3]的方法，從增生期血管瘤組織中分離并培養(yǎng)，取第4～10 代血管瘤干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器MS分選柱、CD133免疫磁珠試劑盒(德國Miltenyi公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司)；鹽酸普萘洛爾(美國Sigma公司)；鼠抗人CD31、CD90、CD105抗體(美國Biolegend公司)；胎兒骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、油紅O染色試劑盒(廣州賽業(yè)生物科技公司)；Real Time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；脂肪分化指標(biāo)的一抗(C /EBPα、C /EBPβ、PPARγ)(武漢博士德生物公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)；Real Time PCR儀(美國ABI公司)。

1.3血管瘤干細(xì)胞的分選與培養(yǎng)手術(shù)切取新鮮增殖期血管瘤組織，立即浸入4 ℃的DMEM/20%胎牛血清(FBS)+1%青霉素-鏈霉素(PS)的培養(yǎng)基中，然后迅速送到實(shí)驗(yàn)室。大量的PBS沖洗標(biāo)本后，剪除皮膚、脂肪、血凝塊及其他非瘤體組織，并留取明確的血管瘤組織。將未經(jīng)處理的血管瘤組織用剪刀切碎成小組織塊，浸入0.2%膠原酶中，37 ℃水浴箱中消化約1.5～2 h，棄上清液，DMEM重懸，通過100 μm的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后獲得單細(xì)胞懸液。加入CD133磁珠，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗，棄上清液，重懸后，流入分選柱，通過CD133標(biāo)記的免疫磁珠技術(shù)提純CD133(+)HemSCs，收集細(xì)胞，然后培養(yǎng)于EGM-2/20%FBS+ 1%PS培養(yǎng)基中。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算HemSCs提取率[6]。培養(yǎng)48 h后，更換培養(yǎng)液，去除漂浮的細(xì)胞和未標(biāo)記的磁珠。當(dāng)原代細(xì)胞匯合成片鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)，用胰蛋白酶消化技術(shù)培養(yǎng)HemSCs并在體外傳代培養(yǎng)。第4～10代HemSCs用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4形態(tài)學(xué)觀察通過倒置顯微鏡，觀察HemSCs接種在96孔培養(yǎng)板上24 h和48 h后細(xì)胞的形態(tài)。隨著細(xì)胞代數(shù)的增加，可以觀察到HemSCs的形態(tài)學(xué)的改變。

1.5流式細(xì)胞術(shù)鑒定血管瘤干細(xì)胞使用PE小鼠抗人CD31、CD90、CD105抗體進(jìn)行檢測。收集第3代HemSCs，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml。離心管為對照，CD31、CD90、CD105，加入500 μl細(xì)胞懸液，后加入5 μl相應(yīng)抗體，4 ℃避光孵育30 min。清洗細(xì)胞2次后加入600 μl PBS，然后通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行上機(jī)檢測。Cytomics CXP軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6油紅O染色檢測HemSCs的成脂轉(zhuǎn)化收集對數(shù)生長期的HemSCs,調(diào)整HemSCs濃度為1×105個(gè)/ml,接種于6孔板中。隔天換液待HemSCs生長到90%融合，用培養(yǎng)基A液即誘導(dǎo)培養(yǎng)基將PRN稀釋成不同濃度(50 μmol/L、100 μmol/L)，替換原培養(yǎng)液，對照組加入培養(yǎng)基A液，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的PRN溶液，3 d后更換為培養(yǎng)基B液即基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基A液繼續(xù)誘導(dǎo)。培養(yǎng)基A液和B液交替培養(yǎng)至脂滴變得足夠大而圓后，PBS沖洗，4%中性甲醛溶液固定30 min后,再次PBS沖洗，加入1 ml油紅O染料工作液30 min，棄去油紅O染液，用PBS沖洗后顯微鏡下觀察細(xì)胞成脂染色效果并拍照。

1.7RealTimePCR法檢測HemSCs脂肪分化的相關(guān)指標(biāo)提前染毒HemSCs(對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組：50 μmol/L、100 μmol/L PRN溶液)，用TRIzol溶液提取RNA。將提取的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，RNase Free dH2O置于冰上，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄為cRNA。在Pubmed上選擇Gene數(shù)據(jù)庫搜索相關(guān)基因，以人ACTB 內(nèi)參引物(NO. B661102)作為內(nèi)參照,PCR引物序列見表1。以cDNA 鏈為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，分析結(jié)果。

表1　PCR使用引物列表

1.8Westernblot法檢測HemSCs脂肪分化的相關(guān)指標(biāo)提前染毒HemSCs(對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組：50 μmol/L、100 μmol/L PRN溶液)，RIPA裂解液裂解并提取蛋白質(zhì)，BCA法蛋白定量后，SDS-PAGE電泳分離，電泳條件：60 V、30 min；120 V、1.5 h。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1～4 h，TBST洗膜3次，每次10 min，一抗室溫孵育1～3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育1～3 h，TBST洗膜3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光，顯影。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，組間顯著差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HemSCs的提取率使用CD133免疫磁珠分離技術(shù)，從嬰幼兒增殖期血管瘤標(biāo)本中分離出HemSCs，運(yùn)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算HemSCs提取率分別為0.27%和0.18%(樣品1和2)，平均約0.36%。

2.2HemSCs的形態(tài)觀察HemSCs接種在96孔板中，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，顯示細(xì)胞呈圓形，同時(shí)可看到許多圓形透亮的未標(biāo)記CD133的免疫磁珠。24 h后再次觀察，顯示圓形細(xì)胞開始變成橢圓形，長條形，形狀多樣且不規(guī)則(圖1A)。48 h后，不規(guī)則形狀的細(xì)胞已經(jīng)變成長梭形擴(kuò)散于孔板中(圖1B)，同時(shí)可看到許多圓形透亮的未標(biāo)記CD133的免疫磁珠和大量未貼壁的死細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察表明，HemSCs的形態(tài)呈長梭形，類似于間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)。其中第4代HemSCs細(xì)胞排列呈螺旋形漩渦狀排列(圖1C)。隨著代數(shù)的增加，HemSCs的形態(tài)從長主軸變?yōu)槿切?，四邊形和不?guī)則形狀。第8代HemSCs仍然具有強(qiáng)大的增殖和集落形成能力(圖1D)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明提取的細(xì)胞高度表達(dá)CD90(98.8%)和CD105(97.8%)，但不表達(dá)CD31(0.7%)(圖2)，符合HemSCs的細(xì)胞表型。

2.4HemSCs的成脂誘導(dǎo)和油紅O染色油紅染色顯示，HemSCs在脂肪培養(yǎng)基培養(yǎng)12～15 d后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有許多紅色脂滴形成。對照組的紅色脂滴數(shù)較實(shí)驗(yàn)組少，且體積偏小，像花環(huán)一樣圍繞著細(xì)胞核一圈。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的紅色脂滴像葡萄串樣聚集在一起，形狀更圓更大(圖3)。且隨著PRN濃度的上升，100 μmol/L組較50 μmol/L組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴數(shù)量有增加趨勢(圖3B、3C)。另外還觀察到實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，HemSCs的數(shù)目和密度有減少趨勢(圖3A、3C)。

圖1　血管瘤干細(xì)胞形態(tài)觀察　SP×100

圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測血管瘤干細(xì)胞表型

圖3　血管瘤干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)和油紅O染色　SP×200

圖4　Real Time PCR檢測各組C /EBPα、PPARγ和C /EBPβ表達(dá)情況

圖5　Western blot法檢測各組C /EBPα、PPARγ和C /EBPβ的表達(dá)情況

2.5RealTimePCR法檢測HemSCs脂肪分化的相關(guān)指標(biāo)C /EBPα指標(biāo)在50 μmol/L PRN溶液干預(yù)后，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是在100 μmol/L PRN溶液干預(yù)后，與對照組相比RNA水平上升，是對照組的3.2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PPARγ和C/EBPβ指標(biāo)經(jīng)50 μmol/L和100 μmol/L PRN溶液干預(yù)后，與對照組相比RNA水平都顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

2.6Westernblot法檢測HemSCs脂肪分化的相關(guān)指標(biāo)HemSCs經(jīng)不同濃度PRN溶液干預(yù)后，Western blot法檢測HemSCs脂肪分化相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)水平改變趨勢與Real Time PCR法檢測HemSCs脂肪分化相關(guān)指標(biāo)RNA水平變化相一致(圖5)。

3　討論

IHs是兒童時(shí)期最常見的良性血管腫瘤,由紊亂的血管和不成熟的血管細(xì)胞組成。2008年P(guān)RN治療血管瘤被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過近十年的大量研究，PRN已經(jīng)代替激素成為治療IHs的突破性治療方法。但是關(guān)于其治療機(jī)制仍然不清楚。在此之后，HemSCs被Khan et al[3]從血管瘤瘤體組織中成功分離，并重建了獨(dú)特的IHs演變過程，學(xué)者們才把目光集中到HemSCs的研究上來。Boye et al[7]認(rèn)為血管瘤是HemSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞的表型而形成。

IHs的生物過程復(fù)雜，有自行消退的特點(diǎn)，通常表現(xiàn)為3個(gè)不同的階段，即增殖階段、消退階段以及消退完成階段[8]。消退完成時(shí)，其特征性表現(xiàn)是纖維脂肪組織包繞塌陷的血管結(jié)構(gòu)，這些獨(dú)特的生理特點(diǎn)明顯區(qū)別于血管畸形。Khan et al[3]在進(jìn)行HemSCs研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)，HemSCs在消退期會(huì)分化為脂肪細(xì)胞。脂化通常與C/EBPα、C/EBPβ以及PPARγ這3種因子相關(guān)。當(dāng)特定細(xì)胞接收到脂肪轉(zhuǎn)化相關(guān)信號后，轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ表達(dá)增加，誘導(dǎo)C/EBPα和PPARγ上調(diào)，促進(jìn)與脂肪形成有關(guān)的基因表達(dá)增加，加速脂化過程。

本研究中，參考Khan et al[3]的HemSCs分選培養(yǎng)方法，并稍作修改，使膠原酶的消化時(shí)間從30 min延長至1.5～2 h，目的是為了提高單細(xì)胞懸液的質(zhì)量，進(jìn)而提高HemSCs的提取產(chǎn)率。而后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測其細(xì)胞表型，細(xì)胞高度表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和CD105，但不表達(dá)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為HemSCs。HemSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基作用后，油紅染色顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有許多紅色脂滴形成，并且實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的紅色脂滴與對照組相比數(shù)量多且形狀更大更圓，證實(shí)HemSCs有向脂肪細(xì)胞分化的潛能，并且PRN干預(yù)后，加速了HemSCs的脂化。隨后用Real Time PCR法和Western blot法檢測不同濃度PRN溶液干預(yù)下HemSCs脂化相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果顯示PPARγ和C/EBPβ指標(biāo)經(jīng)50 μmol/L和100 μmol/L PRN溶液干預(yù)后，與對照組相比RNA及蛋白水平都顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C /EBPα指標(biāo)在50 μmol/L和100 μmol/L PRN溶液干預(yù)后，與對照組相比，趨勢不一致。雖然C /EBPα在50 μmol/L PRN溶液干預(yù)下相比于對照組RNA水平有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C /EBPα在100 μmol/L PRN溶液干預(yù)后，與對照組相比RNA水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果與成脂誘導(dǎo)分化后油紅O染色結(jié)果相一致，從側(cè)面驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的假設(shè)。

IHs的發(fā)生在臨床上很常見，不僅給患兒帶來了生理和心理上的巨大的痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此次的研究成果有助于揭示PRN治療IHs的機(jī)制，也將為臨床上更好的運(yùn)用PRN治療血管瘤提供理論新依據(jù)。

參考文獻(xiàn)