人重組血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞增殖凋亡的影響

張紅利，張曉翠，李　秀，趙其星，鄧　芳

過敏性紫癜性腎炎(Henoeh-Sehonlein purpura nephritis，HSPN)是過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purura, HSP)嚴(yán)重的并發(fā)癥。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球內(nèi)重要的固有細(xì)胞，在HSPN的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。血管緊張素Ⅱ(angiotensinII, AngII)可致腎小球系膜細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)其凋亡。近來研究[1-3]顯示血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme2, ACE2)是具有多種生物學(xué)活性的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)新成員，在血管減壓、心血管、腎臟等疾病中發(fā)揮著保護(hù)作用，可以拮抗AngII，但ACE2能否拮抗AngII所誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖目前尚不清楚。該實(shí)驗通過體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞(human renal mesangial cells，HRMC)，研究重組人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(recombinant human angiotensin converting enzyme 2,rhACE2)對AngII誘導(dǎo)的HRMC增殖凋亡的影響，探究其對HSPN是否存在保護(hù)作用，為臨床HSPN疾病的防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑HRMC(廣州吉妮歐生物技術(shù)有限公司)；低糖DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；0.25%胰酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；rhACE2(美國R&D公司)；AngⅡ(英國Torics公司)；MTT試劑(美國Sigma公司)；周期試劑盒、凋亡試劑盒(美國BD公司)。

1.2儀器與設(shè)備HF90/HF240 細(xì)胞培養(yǎng)箱；細(xì)胞超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo fisher scientific公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)的HRMC細(xì)胞生長至80% 融合，棄去舊的培養(yǎng)液， PBS輕輕蕩洗2次，加入1 ml 0.25%胰酶消化，37 ℃溫育1 min，顯微鏡下見細(xì)胞圓縮、間隙增大時，立即棄去消化液，用PBS輕輕蕩洗1次，加入適量含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，使之成為單個懸浮細(xì)胞，分成3瓶，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4細(xì)胞分組將HRMC隨機(jī)分為4組：對照組；AngII組(10-6mol/L)；rhACE2組(0.1 ng/μl)；AngII +rhACE2組：在加入AngII 10-6mol/L的基礎(chǔ)上，分別加入不同濃度的rhACE2(0.001、0.01、0.1 ng/μl)。

1.5HRMC細(xì)胞活力的測定采用MTT法檢測HRMC的細(xì)胞活力。取對數(shù)生長期的HRMC，以5×104個/ml接種于96孔板中，如上分組，置細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。次日加藥物刺激，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，加MTT溶液，37 ℃孵育4 h后加入等體積二甲基亞砜 (DMSO)，酶標(biāo)儀490 nm下測定各孔的吸光度(optical density，OD)值。

1.6HRMC細(xì)胞周期的測定取對數(shù)期生長的HRMC，以5×104個/ml接種于12孔板中，如上分組，置細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。次日加藥物刺激，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后, PBS洗滌后收集細(xì)胞,1 000 r/min離心10 min，棄上清液； 用70 %的冰乙醇4 ℃固定過夜；400 μl PBS重懸細(xì)胞, PBS洗滌2次,重懸細(xì)胞于0.5 ml的PI/RNase staining Buffer,室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.7HRMC細(xì)胞凋亡率的測定取對數(shù)期生長的HRMC，以5×104個/ml接種于12孔板中，如上分組，置細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。次日加藥物刺激，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后, PBS洗滌后收集細(xì)胞,1 000 r/min離心10 min,棄上清液；100 μl Binding Buffer重懸，5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色，室溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

2　結(jié)果

2.1rhACE2對AngII誘導(dǎo)的HRMC細(xì)胞活力的影響與對照組比較，單用rhACE2時OD值變化不大；與對照組比較，AngII組OD值明顯增加，HRMC細(xì)胞活力增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.171,P<0.05)。與AngII組比較，AngII+rhACE2組OD值明顯減小，且隨著rhACE2濃度增加OD值減小，細(xì)胞活力減?。黄渲?.1 ng/μl rhACE2抑制作用最顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.171,P<0.05)。見表1。

2.2rhACE2對AngII誘導(dǎo)的HRMC細(xì)胞周期變化的影響與對照組比較，rhACE2組S期細(xì)胞比例減少，G0/G1期增多，但是變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，AngII組S期細(xì)胞比例明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.816,P<0.05)；G0/G1期減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.822,P<0.05)，AngII可促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。與AngII組比較，AngII+rhACE2組S期細(xì)胞比例減少，G0/G1期增多，且呈劑量依賴性變化。當(dāng)rhACE2濃度為0.1 ng/μl時，S期細(xì)胞比例明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.816,P<0.05)，rhACE2抑制細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。見表2。

表1　MTT檢測rhACE2對AngII誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較：*P<0.05；與AngII組比較：#P<0.05

2.3rhACE2對AngII誘導(dǎo)的HRMC細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，AngII組細(xì)胞凋亡率減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與AngII組比較，AngII+rhACE2組細(xì)胞凋亡率增加，rhACE2抑制了AngII對系膜細(xì)胞的作用，使增生系膜細(xì)胞的凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=26.415,P<0.05)。見表3、圖1。

3　討論

HSP是一種比較常見的微血管變態(tài)反應(yīng)性出血性疾病[4], 主要特征為全身性廣泛的小血管炎，尤其是皮膚和腎臟的小血管，主要表現(xiàn)為皮膚紫癜、關(guān)節(jié)痛、胃腸出血和血尿[5]。HSPN是HSP的嚴(yán)重并發(fā)癥，占HSP患者的30%～50%[6]。90%的患兒在患HSP 8周后出現(xiàn)腎臟損傷。腎活檢下腎小球病變呈多樣性，以系膜增生常見，容易出現(xiàn)灶狀節(jié)段性纖維素樣壞死，白細(xì)胞增多，炎癥浸入和間質(zhì)纖維化，新月體形成，免疫熒光顯微鏡顯示顆粒性免疫球蛋白A在系膜區(qū)沉積[7-8]。HSPN的進(jìn)展極大程度的影響了HSP的預(yù)后。

圖1　rhACE2對AngII誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡的影響

組別rhACE2濃度(ng/μl)G0/G1(%)S(%)G2/M(%)對照-51.65±3.6838.22±2.7710.13±6.42rhACE2-50.94±1.0236.90±0.5812.16±1.32AngII-42.24±1.51*46.57±1.69*11.20±3.11AngII+rhACE20.00145.07±2.8143.37±0.6311.56±2.59AngII+rhACE20.0146.40±3.6343.10±2.7410.50±3.67AngII+rhACE20.148.38±3.2240.49±1.66#11.13±3.62

與對照組比較：*P<0.05；與AngII組比較：#P<0.05

表3　rhACE2對AngII誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較:*P<0.05;與AngII組比較:#P<0.05

RAS是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓、 血流和內(nèi)環(huán)境重要因素之一，在腎臟病發(fā)展過程中RAS也起著重要的作用。傳統(tǒng)的經(jīng)典理論認(rèn)為RAS由腎素原、腎素、血管緊張素Ⅰ(angiotensin Ⅰ, AngⅠ)、 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)、AngⅡ、血管緊張素受體組成。AngⅡ是整個RAS的中心環(huán)節(jié),作用于AngⅡ 1型受體,引起腎小球內(nèi)高濾過損傷,導(dǎo)致腎小球超濾系數(shù)下降，刺激系膜細(xì)胞的增生和肥大，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增加，可影響腎病的進(jìn)展和預(yù)后。而與其在功能上相拮抗的ACE2-Ang(1-7)-Mas軸的發(fā)現(xiàn)，使人們認(rèn)識到RAS的調(diào)節(jié)機(jī)制是動態(tài)平衡的。新近研究[9]顯示AngI及AngII均可被ACE2水解去除羧基端一個氨基酸殘基，分別生成Ang (1-9)及具有血管舒張作用的Ang(1-7)。Ang(1-7)與G蛋白偶聯(lián)受體Mas結(jié)合發(fā)揮舒張血管、抗增殖、抗纖維化等生物效應(yīng)。ACE2作為該軸中的關(guān)鍵酶，其在腎臟疾病治療方面的潛在應(yīng)用價值。

本研究顯示AngII作用于HRMC促使細(xì)胞活力增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，這與之前研究[10]的AngII促使系膜細(xì)胞增殖是一致的。HSPN累及到腎臟，腎小球系膜細(xì)胞增殖，系膜區(qū)擴(kuò)張，細(xì)胞外基質(zhì)沉積。正常組織中，細(xì)胞增殖與凋亡處于一個動態(tài)平衡，貫穿于整個生命體的始終。細(xì)胞增殖增加和(或)凋亡減少都會打破這個動態(tài)平衡，導(dǎo)致機(jī)體的異常狀態(tài)。細(xì)胞凋亡是在生理或病理刺激下，機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定由基因控制的細(xì)胞主動死亡的過程。因此有效地抑制系膜細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)增殖的系膜細(xì)胞凋亡，成為防治HSP、延緩HSPN進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。本研究顯示在應(yīng)用AngII的基礎(chǔ)上加入rhACE2，使AngII誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖作用減弱并成劑量依賴性增強(qiáng)。本研究還顯示rhACE2能抑制細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，且促進(jìn)增殖的系膜細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖減少、凋亡增加，從而細(xì)胞數(shù)目減少，這也與本研究中細(xì)胞活力減小實(shí)驗一致。以往研究[11]表明，Ang(1-7)可抑制AngII所誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖。據(jù)此推測rhACE2對AngII誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖的抑制作用也許與rhACE2水解AngII，使AngII含量減少，并且生成的Ang(1-7)能抑制系膜細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡有關(guān)。

在糖尿病大鼠腎臟中腎小管ACE2表達(dá)下降[12]。既往研究[13]指出，rhACE2延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。糖尿病腎病主要累及腎小球，導(dǎo)致腎小球硬化，主要表現(xiàn)為腎小球系膜增生。同樣地，HSPN患者體內(nèi)AngII增多，同時有系膜增生伴不同程度的多種細(xì)胞增殖、小灶性壞死、滲出，腎小球玻璃樣變，基質(zhì)增厚，腎小球濾過率下降，最終可有局灶性階段性瘢痕形成而導(dǎo)致硬化，導(dǎo)致腎臟疾病進(jìn)一步發(fā)展惡化。而本研究結(jié)果rhACE2可抑制AngII誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，促使增生的系膜細(xì)胞凋亡，防止腎臟損傷及病情的進(jìn)一步進(jìn)展，推測增加ACE2水平或許可以延緩HSPN的發(fā)展。以上結(jié)果都指出rhACE2抑制AngII誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，關(guān)于ACE2能否應(yīng)用于機(jī)體組織，發(fā)揮抑制系膜細(xì)胞增殖作用，抑制AngII所致使的組織器官損傷，緩解腎臟組織重構(gòu)等發(fā)展，這將關(guān)系到HSPN治療的一個新的方向，關(guān)于這方面有待于進(jìn)一步的研究。