二甲雙胍對于代謝綜合征SD大鼠前列腺增生的影響

徐從云，黃　濤，潘大慶，肖　峻

良性前列腺增生癥(benign prostatic hyperplasia, BPH)是中老年男性常見疾病，有統(tǒng)計顯示在50～60歲和80歲以上的老年男性中BPH發(fā)病率分別高達50%和90%[1]。BPH可以導致排尿困難、泌尿系感染、泌尿系結石，甚至梗阻性腎病、腎功能衰竭等并發(fā)癥[2]。代謝綜合征是一組復雜的代謝紊亂癥候群[3]。研究[4-5]表明高脂高糖飲食所致的代謝綜合征和胰島素抵抗，與前列腺增生的發(fā)生發(fā)展密切相關。二甲雙胍是一種胰島素增敏劑，常用于治療Ⅱ型糖尿病。該研究通過高脂高糖飼養(yǎng)SD大鼠誘發(fā)代謝綜合征，通過用二甲雙胍干預治療，觀察胰島素增敏劑對高脂高糖飲食飼養(yǎng)的SD大鼠的胰島素抵抗水平、前列腺增生程度所產(chǎn)生的影響，并探討Ⅱ型5α還原酶(SRD5A2)的表達與大鼠前列腺增生發(fā)生發(fā)展的關系，進而尋找BPH防治的新思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組健康SPF級SD雄性大鼠20只，由安徽省立醫(yī)院實驗動物中心提供，購入時4周齡，每只約70 g，隨機分為普通飼養(yǎng)組(5只)和高脂高糖飼養(yǎng)組(15只)，高脂高糖飼料在普通飼料的基礎之上加入豬油10%、白砂糖7%、全脂奶粉10%、雞蛋6%、土豆淀粉2%。高脂高糖飼養(yǎng)組再隨機分為高脂高糖空白對照組(5只)、高脂高糖生理鹽水組(5只)和高脂高糖二甲雙胍組(5只)。

1.2藥物干預購入后前3天均進行適應性飼養(yǎng)。高脂高糖空白對照組、高脂高糖生理鹽水組和高脂高糖二甲雙胍組分別予以高脂高糖飼養(yǎng)、高脂高糖飼養(yǎng)加生理鹽水灌胃(10 ml/d)和高脂高糖飼養(yǎng)加二甲雙胍灌胃[20 mg/(kg·d)]。

1.3獲取參數(shù)40 d后實驗結束，測體質量，取材前12 h禁食水，尾尖取血測空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，腹腔注射麻醉后(10%水合氯醛,按3 ml/kg的劑量)，打開腹腔，心臟采血測空腹血漿胰島素(fasting plasma insulin, FINS)，解剖獲得前列腺組織，剔除前列腺周圍脂肪并在吸水紙上吸干，稱重計算前列腺指數(shù)[前列腺指數(shù)=前列腺濕重(mg)/大鼠體質量(100 g)]，胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)是用于評價個體的胰島素抵抗水平的指標。HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(μIU/L)/22.5[6]。

1.4主要儀器和試劑FBG測定使用羅氏血糖儀Accu-chek及配套試紙。FINS測定采用放免法，Western blot所使用全蛋白提取試劑盒購自南京凱基公司；PVDF膜購自美國Milipore公司；SRD5A2、β-actin特異性抗體購自美國abcam公司；伊紅染色劑、免疫組織化學染色所使用SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.5化學染色福爾馬林液固定前列腺組織，脫水、浸蠟、石蠟包埋、4 μm切片，用蘇木精-伊紅染色觀察拍照。石蠟包埋切片標本使用二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復、封閉內源性過氧化物酶活性后，加一抗稀釋液(博奧森公司SRD5A2抗體，1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，加即用型二抗室溫孵育1 h；DAB顯色、蘇木精復染；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片鏡檢拍照。

1.6Westernblot提取組織總蛋白后標準曲線法檢測蛋白濃度；混合上樣緩沖液后置于沸水中3 min，等量上樣，SDS-PAGE凝膠電泳；半干轉膜法將蛋白轉移至PVDF膜上；PVDF膜置于封閉液中1 h，漂洗后置于一抗稀釋液(博奧森公司SRD5A2抗體，1 ∶500稀釋)4 ℃過夜，漂洗后置于二抗液室溫2 h，漂洗后ECL化學發(fā)光顯影定影；Image J軟件檢測計算條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度比值計算表達量。

2　結果

2.1代謝綜合征模型和藥物干預4組大鼠FBG水平差異均無統(tǒng)計學意義。高脂高糖空白對照組與普通飼養(yǎng)組相比FINS水平明顯增高,結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，高脂高糖二甲雙胍組與高脂高糖生理鹽水組相比FINS水平明顯降低(P<0.05)。高脂高糖空白對照組與普通飼養(yǎng)組的HOMA-IR相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，證明代謝綜合征模型建立成功。高脂高糖二甲雙胍組和高脂高糖生理鹽水組HOMA-IR相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明胰島素增敏劑二甲雙胍可以降低高脂高糖飼養(yǎng)所誘發(fā)的胰島素抵抗和代謝綜合征癥狀。見表1。

2.2稱重結果高脂高糖飼養(yǎng)大鼠體質量均顯著高于普通飼養(yǎng)組，高脂高糖飼養(yǎng)后大鼠體質量顯著增加的同時，前列腺重量、前列腺指數(shù)和普通飼養(yǎng)組相比顯著升高(P<0.05)，表明高脂高糖飼養(yǎng)誘發(fā)的代謝綜合征可導致前列腺增生。高脂高糖二甲雙胍組與高脂高糖生理鹽水組相比前列腺重量、前列腺指數(shù)明顯降低(P<0.05)，說明胰島素增敏劑可以改善代謝綜合征所致的前列腺增生。見表1。

2.3前列腺組織HE染色普通飼養(yǎng)組大鼠前列腺無明顯增生，腺上皮呈單層柱狀或立方樣改變，管腔擴大不明顯，分泌物染色呈粉紅色改變。高脂高糖空白對照組和高脂高糖生理鹽水組大鼠前列腺腺體的體積明顯增大，腺體層次增多，呈乳頭樣增生，接近腺腔短徑1/3～1/2，腺體管腔增大，排列擁擠，間質內脂肪增多，小葉增多，分泌亢進。高脂高糖二甲雙胍組前列腺增生程度較對照組減輕，上述組織學變化均在不同程度上改善，細胞層數(shù)減少，間質內脂肪細胞量減少，見圖1。

表1　各組大鼠相關參數(shù)比較

與普通飼養(yǎng)組比較：*P<0.05；與高脂高糖生理鹽水組比較：#P<0.05

圖2　各組大鼠前列腺組織SRD5A2免疫組織化學染色　×200

2.4免疫組織化學染色檢測SRD5A2的表達免疫組織化學染色結果顯示正常前列腺組織和增生前列腺組織均表達SRD5A2，著色部位主要位于胞質內，以前列腺腺上皮著色為主，腺體的基底細胞與腺體間質細胞著色較淺。SRD5A2在增生前列腺中染色較深，且分布不均勻，增生前列腺結節(jié)內的染色要強于周圍組織，尿道周圍腺上皮細胞中SRD5A2的染色強度明顯深于包膜下腺體。見圖2。

2.5Westernblot檢測SRD5A2的表達Western blot結果(圖3)顯示SRD5A2蛋白在高脂高糖飼養(yǎng)誘發(fā)代謝綜合征組大鼠前列腺增生組織中高表達，表達量顯著高于普通飼養(yǎng)組，二甲雙胍干預后的代謝綜合征大鼠前列腺組織中SRD5A2表達量顯著降低。SRD5A2在大鼠前列腺中的表達與增生程度呈正相關性。

圖3　各組大鼠前列腺組織中SRD5A2蛋白的表達

1：普通飼養(yǎng)組 2：高脂高糖空白對照組 3：高脂高糖生理鹽水組4：高脂高糖二甲雙胍組

3　討論

目前我國人口老齡化加速，中國成為世界老年人口最多的國家，同時隨著飲食結構的改變，老年病和代謝性疾病發(fā)病率逐年升高。有研究[7-8]顯示代謝綜合征和良性前列腺增生癥的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系。且高脂高糖飲食所致的代謝綜合征及胰島素抵抗，可能影響B(tài)PH發(fā)生發(fā)展的重要因素[4-5]。胰島素抵抗指的是機體對胰島素敏感組織對胰島素的反應性降低，胰腺β細胞代償性地分泌更多的胰島素，因此出現(xiàn)代償性高胰島素血癥。胰島素抵抗和繼發(fā)的高胰島素血癥是代謝綜合征的基本特征[9]。穩(wěn)態(tài)模型評估法(homeostasis model assessment，HOMA)廣泛應用于評價胰島素敏感性，其中HOMA-IR是最常用的評價個體胰島素抵抗水平的指標[6]。本實驗中高脂高糖飲食飼養(yǎng)的SD大鼠，測得HOMA-IR明顯高于普通飼養(yǎng)組，證明代謝綜合征模型成功建立。與普通飼養(yǎng)組相比，代謝綜合征大鼠前列腺腺體的體積明顯增大，腺體層次增多，分泌亢進等表現(xiàn)。這說明胰島素抵抗可能是連接BPH和代謝綜合征兩種疾病的重要病因學紐帶[10]。

先前有研究[11]表明胰島素樣生長因子家族蛋白(insulin-like growth factors, IGFs)軸可能是代謝綜合征影響B(tài)PH的發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)與胰島素生長因子-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)是IGFs中兩個重要的多肽蛋白，代謝綜合征個體中高表達的IGF-1與列腺上皮細胞中同樣高表達的IGF-1R相結合，活化后通過激活細胞PI3/AKT和MAPK信號通路，誘導DNA的轉錄和翻譯，促進有絲分裂、細胞增殖及抑制細胞凋亡，從而誘發(fā)BPH。二甲雙胍作為臨床上常用的胰島素增敏劑，廣泛應用于治療代謝綜合征、Ⅱ型糖尿病、多囊卵巢綜合征等胰島素抵抗為核心的多種疾病[12]。研究[13]顯示二甲雙胍在抑制前列腺上皮細胞增殖的同時，顯著下調IGF-1R活性，同時抑制IGF-1對于IGFs軸的活化功能，且二甲雙胍通過對前列腺上皮細胞的周期調節(jié)蛋白家族表達功能下調，可將前列腺上皮細胞周期阻滯在靜止期。本實驗建立的模型顯示代謝綜合征大鼠前列腺增生明顯，而二甲雙胍干預后大鼠前列腺增生腺體組織學變化均在不同程度上得到改善。

SRD5A屬于還原型輔酶Ⅱ依賴的膜結合酶，位于細胞的微粒體，具有將循環(huán)睪酮轉化為雙氫睪酮的生物學作用。有研究[14]顯示SRD5A2主要在前列腺腺上皮細胞中表達，幾乎是前列腺間質細胞中表達強度的2倍。有證據(jù)[15]表明，SRD5A2在增生的前列腺腺體中的表達與前列腺體增生程度呈正相關性，而經(jīng)5-α還原酶抑制劑(非那雄胺)治療后，前列腺尿道周圍區(qū)體積縮小要比被膜下區(qū)更加明顯。本研究通過免疫組織化學染色方法顯示代謝綜合征大鼠尿道周圍腺上皮細胞中SRD5A2的分布多于包膜下腺體。SRD5A2蛋白在代謝綜合征大鼠增生前列腺組織中的表達水平明顯升高，經(jīng)過二甲雙胍干預后，SRD5A2的表達水平較高脂高糖生理鹽水組顯著降低，并且在前列腺組織的表達與BPH程度正相關。SRD5A2的表達及活性調控可能是代謝綜合征所致大鼠前列腺增生過程中的關鍵環(huán)節(jié)。對胰島素增敏劑和5-α還原酶抑制劑治療效果的進一步研究，對揭示代謝綜合征所致前列腺增生的機制和治療靶點提供線索。