宮頸鱗癌中CD44分子變異體的表達(dá)分析

王　娟，宋偉國，申　震，吳大保，周　穎

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株人類宮頸癌細(xì)胞系SiHa、HeLa、ME-180細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2實驗材料反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京Promega公司；PrimerSTAR PCR酶購自日本TaKaRa公司；Agarose購自合肥志宏生物公司；單克隆鼠抗人CD44v6抗體購自英國Abcam公司；CD44s抗體購自北京中杉金橋公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物購自美國BIO-RAD公司。組織切片來自安徽省立醫(yī)院2005～2011年手術(shù)切除、并經(jīng)病理診斷為宮頸鱗癌標(biāo)本30例。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SiHa細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基，ME-180細(xì)胞用McCoy’s 5A培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清(FCS)，青霉素10 U/ml和鏈霉素100 μg/ml,置于37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2qRT-PCR用TRIzol試劑抽取 SiHa、HeLa、ME-180細(xì)胞的總RNA，取500 ng RNA 反轉(zhuǎn)成 cDNA。利用SYBR Green檢測CD44各種變異體的表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參對照。引物序列見表1。在qRT-PCR分析軟件中進(jìn)行板布局，通過雙Δ法分析數(shù)據(jù)。

第四，加強(qiáng)前期工作，全面加快水利基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)步伐。重點水利工程前期工作取得新進(jìn)展。太浦閘除險加固工程正在進(jìn)行開工準(zhǔn)備工作；加快太湖流域水資源監(jiān)控與保護(hù)預(yù)警系統(tǒng)立項進(jìn)程；新孟河、望虞河西岸控制工程、新溝河、太嘉河等工程正在加快推進(jìn)。流域民生水利建設(shè)取得新發(fā)展。完成了流域片病險水庫（水閘）除險加固初步設(shè)計復(fù)核工作，完成63個縣山洪災(zāi)害防治縣級非工程措施建設(shè)實施方案審核工作。直屬項目建設(shè)取得較大突破。望亭水利樞紐更新改造工程已基本完成。浙皖水環(huán)境監(jiān)測中心已經(jīng)完建，青浦水文巡測基地、杭州灣水文基地、水環(huán)境監(jiān)測中心實驗室、太湖水行政執(zhí)法基地建設(shè)全力推進(jìn)。

1.2.3PCR和凝膠電泳采用圖1B位置設(shè)計CD44各種亞型引物，具體引物序列見表1。以SiHa、HeLa、ME-180 CDNA為模板，相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物跑2%的agarose膠驗證條帶大小，切膠送擎科生物測序。

1.2.4免疫組化將獲得的宮頸鱗癌石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟、水化，于0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖修復(fù)液中微波加熱抗原修復(fù)，待涼至室溫，加3% H2O2溶液室溫孵育30 min,山羊血清室溫下封閉20 min,滴加1 ∶300 CD44v6、即用型CD44s單克隆抗體孵育4 h，滴加二抗室溫反應(yīng)30 min,DAB顯色，蘇木精淺染細(xì)胞核，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取至少3個視野，通過光學(xué)顯微鏡對組織切片根據(jù)著色強(qiáng)度評分：未著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性范圍0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，最后綜合兩部分得分相乘，再進(jìn)行比較。

表1　qRT-PCR引物序列

圖1　CD44基因結(jié)構(gòu)、可變剪切形式及引物設(shè)計

A:CD44不同剪切方式形成的常見亞型; B:CD44各種亞型引物設(shè)計位置

1.2.5Western blot法檢測2×loading buffer收取狀態(tài)好的SiHa、HeLa、ME-180細(xì)胞，超聲裂解，蛋白變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉，一抗CD44(1 ∶1 000)與actin(1 ∶1 000)過夜，TBST洗膜洗3次，加入相應(yīng)的二抗孵育，洗膜ECL顯影得到CD44v6與actin蛋白表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0和GraphPad Prism6軟件進(jìn)行分析，兩樣本比較采用t檢驗，臨床樣本采用fisher精確性檢驗(樣本量小于40)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SiHa、HeLa、ME-180宮頸鱗癌細(xì)胞系CD44變異體表達(dá)水平qRT-PCR結(jié)果顯示，SiHa、HeLa細(xì)胞中可以檢測到CD44s、v2～v10亞型，以v6亞型為主，其次為s亞型(P<0.0001)， ME-180細(xì)胞中可以檢測到CD44s、v2～v10亞型，CD44v亞型明顯高于CD44s亞型，以CD44v6為主(P=0.003)(圖2A)。凝膠電泳結(jié)果進(jìn)一步證實，SiHa、HeLa細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄水平以CD44s、CD44v6變異體為主；ME-180細(xì)胞系主要表達(dá)CD44v型變異體，以CD446型變異體為主(圖2B)。

2.2SiHa、HeLa、ME-180宮頸鱗癌細(xì)胞系均表達(dá)CD44v6亞型鑒于子宮頸鱗癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平檢測到的CD44的主要亞型為v6，通過Western blot在蛋白水平檢測CD44v6亞型，結(jié)果確證了SiHa、HeLa、ME-180宮頸癌細(xì)胞系均表達(dá)CD44v6亞型，見圖3。

2.3宮頸鱗癌組織中CD44v6蛋白表達(dá)鑒于子宮頸鱗癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄及翻譯水平檢測到的CD44的主要亞型為v6，因此，對30例宮頸鱗癌組織進(jìn)行免疫組化檢測其細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示CD44v6定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈深淺不同的棕黃色，見圖4。

2.4CD44v6強(qiáng)表達(dá)與宮頸鱗癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系進(jìn)一步選擇了30例宮頸鱗癌組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CD44v6陽性者29例(96.70%)，鑒此，根據(jù)免疫組化評分，將CD44v6表達(dá)分為強(qiáng)陽性(≥9分)，弱陽性(<9分)，并根據(jù)宮頸鱗癌分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、預(yù)后、分化程度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，宮頸鱗癌患者的臨床分期越晚、有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、患者的生存期越短的癌組織中CD44v6基因表達(dá)水平越高,與分化程度無關(guān)(表2)。

圖2　qRT-PCR、凝膠電泳檢測SiHa、HeLa、ME-180宮頸癌細(xì)胞系中CD44各亞型mRNA表達(dá)水平A：qRT-PCR; B:凝膠電泳

圖3　Western blot法檢測子SiHa、HeLa、ME-180宮頸癌細(xì)胞株中的CD44v6蛋白水平

3　討論

可變剪切是指同一個基因不同外顯子以多種方式重連，形成不同的mRNA，由此產(chǎn)生了不同的蛋白?？勺兗艚訁⑴c很多重要的生命活動，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、血管生成、細(xì)胞運動和EMT等[6]。CD44作為擁有多種可變剪切方式的I型跨膜糖蛋白家族，近來備受關(guān)注。CD44是HA受體，主要調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞及ECM間的黏附作用，CD44基因經(jīng)過選擇性剪切和大量轉(zhuǎn)錄后修飾形成了多種CD44變異體，不同變異體生物學(xué)功能各不相同[7-8]，如CD44s存在于大部分真核細(xì)胞中， 而CD44v主要表達(dá)于炎癥和腫瘤細(xì)胞。有研究顯示CD44各亞型通過激活STAT3[9]、Snail[10]、Wnt等信號途徑以及miR-106b[11]來調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,然而也有學(xué)者持相反的觀點[12]。最近研究表明,在胰腺癌[5]、胃癌[13]、乳腺癌的癌變中均有CD44s變異體轉(zhuǎn)向CD44v6，可能是因為CD44v6使存在于腫瘤細(xì)胞表面粘附因子的形態(tài)與功能發(fā)生改變，利于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移[14]。由于CD44各亞型在腫瘤進(jìn)展的作用說法不一[5]，宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，明確宮頸癌CD44分子變異體的表達(dá)情況是判斷CD44各亞型功能的前提。

圖4　免疫組化檢測宮頸癌組織中CD44v6蛋白的表達(dá)水平及部位

因素nCD44v6表達(dá)+-P值CD44v6表達(dá)強(qiáng)陽性≥9分<9分P值分期 ≤Ⅱ期18171810 >Ⅱ期121200.6001110.010分化程度 高、中1716198 低131300.5671030.167淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無232211211 有7700.767700.025生存期 ≥5年212011011 <5年9900.700900.012

本研究表明，在宮頸鱗癌細(xì)胞系SiHa、HeLa、ME-180中CD44各亞型表達(dá)情況并非相同，在 SiHa和HeLa是以CD44s和CD44v6變異體為主，而ME-180CD44v型明顯高于CD44s型，以CD44v6為主。多篇文章報道可變剪切涉及各種生物過程，包括細(xì)胞循環(huán)、能量運輸、生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可變剪切失調(diào)導(dǎo)致人類疾病包括癌癥[15]。更有報道[13]表明癌變中有CD44s變異體轉(zhuǎn)向CD44v6。在宮頸癌細(xì)胞系存在明顯的可變剪切形式的不同，這種不同是否導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移仍需進(jìn)一步闡釋，需要進(jìn)一步深入討論。值得注意的是，CD44v6在這三種宮頸鱗癌細(xì)胞系均有很高的表達(dá)，并通過宮頸鱗癌組織中也同樣證實了這點，免疫組化結(jié)果顯示CD44主要位于宮頸癌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，是一個多結(jié)構(gòu)多功能的跨膜糖蛋白，與選擇素、整合素和鈣黏蛋白一起構(gòu)成巨大的CAMs，而CAM通過介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附來調(diào)控組織的完整性，故其表達(dá)部位可能與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。30例宮頸癌組織CD44v6表達(dá)率高達(dá)96.70%，且本研究結(jié)果顯示，CD44v6蛋白表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移受累、不良預(yù)后正相關(guān)。提示CD44v6在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要的作用，可能作為宮頸鱗癌預(yù)后的指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)