依達(dá)拉奉對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元凋亡的影響

林思寧，李建民，劉俊杰，李群喜，薛承景，趙雅寧，付愛(ài)軍

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，其后遺癥一直是危害人類健康的主要因素之一，研究[1]表明TBI后出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，TBI后遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡是產(chǎn)生繼發(fā)性腦損害的重要途徑。目前，對(duì)顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚未完全闡明，如何阻制顱腦損傷后遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡是當(dāng)前TBI的研究熱點(diǎn)之一。依達(dá)拉奉是一種新型神經(jīng)保護(hù)劑，具有氧自由基清除能力和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[2]。該研究通過(guò)構(gòu)建閉合性顱腦損傷模型，探討依達(dá)拉奉對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響和神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器依達(dá)拉奉(批號(hào)：20150355；規(guī)格：30 mg/20 ml)購(gòu)自南京先聲藥業(yè)有限公司；兔抗人Fas多克隆抗體、兔抗人門冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8，Caspase-8)多克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；PV-6001/6002二步法組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購(gòu)自上海赫澎生物科技有公司。Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；自由落體打擊裝置及顯微外科解剖器械均由華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組及構(gòu)建大鼠顱腦創(chuàng)傷模型96只健康SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為4組：正常組、假手術(shù)組、模型組、藥物組，每組24只。參照Marmarou et al[3]構(gòu)建大鼠閉合型腦創(chuàng)傷模型，用40 g砝碼從25 cm高處墜落致重型腦損傷，假手術(shù)組僅切開(kāi)頭皮縫合，不予以打擊，不傷腦組織。分籠飼養(yǎng)，于術(shù)后2～8 h恢復(fù)飲食；正常組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.2.2給藥方法藥物組于模型制作成功后即刻經(jīng)尾靜脈注射給藥，依達(dá)拉奉，每次3 mg/kg，2次/d，直至各時(shí)相點(diǎn)處死；正常組、假手術(shù)組、模型組在相同時(shí)間內(nèi)給予等量生理鹽水尾靜脈注射。

1.2.3腦組織取材與標(biāo)本制備術(shù)后72 h選取Wistar大鼠，4%水合氯醛10 ml/kg麻醉，快速開(kāi)胸暴露心臟，灌注生理鹽水，隨后灌注4%多聚甲醛至軀干僵硬時(shí)，斷頭取腦，4%多聚甲醛固定液中固定48 h以上。取出腦組織標(biāo)本，以損傷灶為中心，切取厚約4 mm左右的組織標(biāo)本，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，視交叉處始冠狀面連續(xù)切片，厚度為4.5 μm，60 ℃烤箱烘烤4 h后，室溫下保存?zhèn)溆?，用于免疫組化和TUNEL染色。每組另取腦組織0.5 g，放入4 ℃生理鹽水，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成100 g/L的腦勻漿，低溫離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃凍存，用于檢測(cè)MDA、SOD水平。

1.2.4血清MDA、SOD測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)檢測(cè)MDA水平，采用羥胺法檢測(cè)SOD水平，按照說(shuō)明書(shū)操作[4]。取出上清液，滴加2 μl的樣品上清液于96孔板，每孔加100 μl的BCA混合液，用酶標(biāo)儀(562 nm)測(cè)OD值，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，分別檢測(cè)MDA和SOD水平。

1.2.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Fas、Caspase-8表達(dá)常規(guī)海馬組織切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育，滅活內(nèi)源性過(guò)氧物酶，枸櫞酸鹽溶液100 ℃沸騰熱修復(fù)抗原；血清封閉液室溫孵育；分別滴加一抗Fas和Caspase-8(1 ∶200)，于4 ℃孵育過(guò)夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37 ℃孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，流水沖洗反藍(lán)，0.1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察并采集照片，采用Image-Pro-Plus圖像分析軟件分析圖片染色結(jié)果，依據(jù)染色分?jǐn)?shù)(染色強(qiáng)度)評(píng)分評(píng)定結(jié)果。

1.2.6TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡常規(guī)海馬組織切片脫蠟脫水，3% H2O2室溫孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗滌3次，每次2 min，胃蛋白激酶K(20 μg/ml)室溫孵育消化15 min，標(biāo)記液(20 μl)37 ℃標(biāo)記2 h，封閉液(50 μl)室溫孵育30 min，生物素化抗地高辛抗體(50 μl)，37 ℃孵育30 min，SABC(50 μl)37 ℃孵育30 min，TBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，甘油封片，并于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取平均值。

2　結(jié)果

2.1各組血清MDA、SOD水平比較各組血清MDA、SOD含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=48.836，P=0.001)、(F=176.460，P<0.001)，模型組MDA量均高于正常組、假手術(shù)組(P<0.05)；藥物組與模型組比較MDA量顯著減少(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組和正常組(P<0.05)；模型組SOD量均低于正常組、假手術(shù)組(P<0.05)；藥物組與模型組比較SOD量顯著增加(P<0.05)，但仍低于假手術(shù)組和正常組(P<0.05)；假手術(shù)組與正常組間兩者的含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1　各組血清MDA、SOD含量比較

與模型組比較：△P<0.05；與藥物組比較：*P<0.05

2.2各組Fas、Caspase-8表達(dá)比較Fas、Caspase-8陽(yáng)性表達(dá)定位于腦組織神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜，陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色染色。見(jiàn)圖1、2。經(jīng)Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)半定量分析得出積分光密度(IOD)值(表2)。各組Fas和Caspase-8表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=120.934、94.597，P<0.001)，模型組Fas和Caspase-8表達(dá)量均高于正常組、假手術(shù)組(P<0.05)；藥物組與模型組比較Fas和Caspase-8表達(dá)量均減少(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組和正常組(P<0.05)；假手術(shù)組與正常組間兩者的表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1　免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織Fas表達(dá)　×400

圖2　免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織Caspase-8表達(dá)　×400

圖3　TUNEL染色檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡　×400

組別FasCaspase-8正常27.84 ±1.29△10.78 ±2.29△假手術(shù)30.16±1.8213.83±3.12模型47.73±2.85*28.55±3.05*藥物38.21±2.0716.02±2.53F值120.93494.597P值<0.001<0.001

與模型組比較：△P<0.05；與藥物組比較：*P<0.05

2.3細(xì)胞凋亡情況TUNEL染色陽(yáng)性凋亡細(xì)胞形態(tài)特征為神經(jīng)元胞體縮小，染色質(zhì)凝集，密度高，呈塊狀或顆粒狀，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒，見(jiàn)圖3。正常組、假手術(shù)組、模型組、藥物組的凋亡細(xì)胞指數(shù)(%)分別為(5.63±0.35)、(6.72±0.48)、(23.82±1.20)、(12.64±0.64)。各組之間凋亡細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.47，P<0.001)，模型組較正常組、假手術(shù)組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)；藥物組較模型組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，但仍高于正常組和假手術(shù)組(P<0.05)；正常組和假手術(shù)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3　討論

TBI導(dǎo)致繼發(fā)性血腦屏障破壞，引發(fā)顱腦水腫，局部缺血低氧導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生造成繼發(fā)性腦損傷。TBI產(chǎn)生的氧自由基可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷生物膜引發(fā)線粒體腫脹破裂，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)并誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5-6]。因此，如能阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，就有可能減輕TBI時(shí)腦損傷程度。

依達(dá)拉奉是一種新型的自由基清除劑，可將一個(gè)電子提供給自由基而達(dá)到清除自由基的目的[7]。因其分子結(jié)構(gòu)含親脂基團(tuán)，易通過(guò)血腦屏障到達(dá)腦組織，主要有清除氧自由基抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，降低血腦屏障通透性，降低腦水腫程度，調(diào)控炎癥因子，減少炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡等，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8-9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要終產(chǎn)物之一，可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，SOD是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶之一，可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力；體內(nèi)MDA含量及SOD活性的變化可反映機(jī)體清除自由基和抗氧化損傷的能力[10]。本研究結(jié)果表明模型組MDA量顯著增加，藥物組較模型組MDA量顯著減少；模型組SOD量顯著降低，藥物組較模型組SOD量顯著增加。說(shuō)明依達(dá)拉奉可有效提高顱腦創(chuàng)傷后腦組織中SOD活力，降低MDA水平。

Fas屬于腫瘤壞死因子受體超家族，F(xiàn)as與FasL結(jié)合或與激動(dòng)抗體交聯(lián)后形成三聚體，再將Caspase-8募集于Fas信號(hào)復(fù)合體，通過(guò)介導(dǎo)Caspase激活的外源性激活途徑，再經(jīng)過(guò)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。本研究結(jié)果顯示，顱腦創(chuàng)傷后大鼠腦組織Fas和Caspase-8表達(dá)明顯增高，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；而依達(dá)拉奉可使大鼠顱腦創(chuàng)傷后Fas和Caspase-8表達(dá)降低，凋亡細(xì)胞數(shù)減少。考慮顱腦損傷后其可能的作用機(jī)制為Fas與其配體FasL結(jié)合，通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)，進(jìn)一步和Caspase-8酶原發(fā)生相互作用，激活Caspase-8酶原，再經(jīng)過(guò)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而自由基清除劑—依達(dá)拉奉可通過(guò)抑制上述Fas介導(dǎo)的死亡受體途徑信號(hào)通路，抑制Fas表達(dá)，進(jìn)一步抑制其下游Caspase-8表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮顱腦保護(hù)作用[12]。