miR-22靶向抑制NLRP3基因?qū)谛牟?nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用

胡　波，張曉剛，李德才

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)是一種多因素共同作用的冠狀動(dòng)脈性心臟疾病，由于脂質(zhì)代謝異常引起動(dòng)脈內(nèi)膜脂類(lèi)物質(zhì)的堆積進(jìn)而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣病變[1-2]，近年來(lái)，冠心病的發(fā)病率呈上升的趨勢(shì)，并且在年齡上越來(lái)越趨向于年輕化[3]。炎癥反應(yīng)是心臟疾病中的一項(xiàng)重要的機(jī)制，該反應(yīng)會(huì)使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊趨于不穩(wěn)定，進(jìn)而可能導(dǎo)致斑塊破裂，促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展[4-6]。該研究[7]顯示許多microRNA (miRNA)分子可以調(diào)控糖脂代謝、平滑肌細(xì)胞增殖以及血管炎癥反應(yīng)，在冠心病的發(fā)病機(jī)制中扮演著關(guān)鍵性的作用。Jazbutyte et al[8]發(fā)現(xiàn)miR-22靶向骨誘導(dǎo)因子(mimecan/osteoglycine, OGN)，可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老。NOD樣受體蛋白3(NLRP-3)炎性小體是一種影響組織損傷、代謝應(yīng)激、感染和炎癥過(guò)程的復(fù)合體[9]。該研究旨在探討miR-22靶向調(diào)控NLRP3基因?qū)谛牟?nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的影響，尋求一種新的方法來(lái)治療冠心病。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康純種SD雄性大白鼠24只，體重(240±60) g，鼠齡3 ～4月，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：HNASLKJ20100330，飼養(yǎng)在帶不銹鋼蓋底的塑料籠內(nèi)，每籠6只，自由飲水。室內(nèi)溫度25 ℃，濕度65%，飲水為普通自來(lái)水，飼料和水均可由大鼠自行隨意攝取。飼養(yǎng)一周適應(yīng)環(huán)境，以降低環(huán)境變更引起的應(yīng)激反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)綿陽(yáng)四0四醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)審核，同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2病理模型的構(gòu)建及分組參照沈麗 等[10]的方法制備冠狀動(dòng)脈粥樣硬化模型，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，正常組喂基礎(chǔ)飼料和普通自來(lái)水，AS組以高脂飼料(2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、3%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3%的基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，在高脂飼料的基礎(chǔ)上加維生素D3粉劑(1.25×106U/kg飼料)喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)于右下肢肌肉注射維生素D3粉針劑(3×106U/kg體重)，每隔30 d重復(fù)一次。正常組和AS組各12只。

1.3血脂和血鈣的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)月后，各組動(dòng)物禁食過(guò)夜，在戊巴比妥鈉腹腔麻醉下，分離腹主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈分叉處下方，剪開(kāi)腹主動(dòng)脈，插入穿刺針，以注射器采集動(dòng)脈血，3 000 r/min離心5 min，分離血漿，取1 ml檢測(cè)血脂和血鈣。使用Abbott Aeroset TM生物化學(xué)分析儀(美國(guó)亞培公司)檢測(cè)各組大鼠血漿總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDLC)和Ca2+的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.4冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定取近心端冠狀動(dòng)脈，將取出的冠狀動(dòng)脈放入盛有PBS和肝素的的器皿中浸泡5 min，防止血液凝固。無(wú)菌PBS沖洗3次，將其置于75%酒精中浸泡15 s，用眼科剪將動(dòng)脈組織剪碎為1 mm3大小的組織塊，加入0.2% Ⅱ型膠原酶3 ml，37 ℃水浴消化6 min，再加入等體積0.25%胰酶，37 ℃水浴消化5 min。消化結(jié)束后，加入3 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。棄上清液，將所得細(xì)胞充懸于完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞孵育箱中孵育，6 h后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% 融合，吸棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍。向瓶?jī)?nèi)加入0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。用移液器輕輕吹打使細(xì)胞脫壁。吸取細(xì)胞懸液并離心，用完全培養(yǎng)液重懸，混合均勻。調(diào)整到合適的密度后接種傳代。含置于37 ℃恒溫的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，每3 d換一次培養(yǎng)液。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法，將細(xì)胞吹打，使用PBS洗滌，加入一抗孵育過(guò)夜。次日，PBS清洗3次，加入二抗，在37 ℃的條件下孵育30 min，DAB顯色，光鏡下觀察記錄。原代冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組待處理的大鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與0.25 mmol/L的同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)共孵育24 h，造冠心病模型。針對(duì)有效促進(jìn)大鼠miR-22基因表達(dá)的靶序列合成其過(guò)表達(dá)RNA的DNA Oligo，并制成雙鏈DNA。與Age I和EcoR I雙酶切后的Pgcsil-gfp載體連接、轉(zhuǎn)化、PCR法篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，酶切并測(cè)序。合成miR-22的過(guò)表達(dá)物(miR-22 mimic)、抑制物(miR-22 inhibitor)及NLRP3基因失活(si NLRP3) ，利用脂質(zhì)體進(jìn)行包裝，待第3代冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，將脂質(zhì)體一定比例稀釋后加入細(xì)胞培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h，構(gòu)成空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染不相干序列)、miR-22 mimic組(轉(zhuǎn)染miR-22的過(guò)表達(dá)物)、miR-22 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-22的抑制物)、miR-22 inhibitor + si NLRP3組(轉(zhuǎn)染miR-22并失活NLRP3基因)。

1.6雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)采用生物信息學(xué)軟件http://www.microrna.org預(yù)測(cè)miR-22 與NLRP3的靶向關(guān)系及miR-22 與NLRP3 3’UTR 的結(jié)合位點(diǎn)。合成含miR-22結(jié)合位點(diǎn)的NLRP3 3’UTR啟動(dòng)子區(qū)序列，構(gòu)建NLRP3 3’UTR野生型(WT)質(zhì)粒(NLRP3 3’UTR-WT)。并在該質(zhì)?；A(chǔ)上，突變結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建NLRP3 3’UTR 突變型(MUT)質(zhì)粒(NLRP3 3’UTR -MUT)。按購(gòu)買(mǎi)的質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)Promega公司)的方法步驟進(jìn)行。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的293T細(xì)胞接種于96 孔板中，在細(xì)胞密度約70 % 時(shí)，Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染，將NLRP3-3′UTR-WT質(zhì)粒和miR-22 mimic質(zhì)?；靹蚝蠊厕D(zhuǎn)染于293T 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)NLRP3-3 ′ UTR-WT+NC(NLRP3 3’UTR野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無(wú)義對(duì)照序列)組、NLRP3-3′UT R-MUT+NC(NLRP3 3’UTR突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無(wú)義對(duì)照序列)組和NLRP3-3′UT R-MUT+miR-22 mimic(NLRP3 3’UTR突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染miR-22 mimic質(zhì)粒)組分別轉(zhuǎn)染于293T 細(xì)胞。培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，更換含10 % FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-22、NLRP3、caspase-1mRNA的表達(dá)水平采用TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)的一步法對(duì)組織和細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，并通過(guò)紫外分析技術(shù)及甲醛變性電泳檢測(cè)對(duì)獲得高質(zhì)量RNA進(jìn)行證實(shí)。取1 μg RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)和合成，以β-actin作為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用OpticonMonitor 3軟件(美國(guó)BioRad公司)分析PCR結(jié)果。手動(dòng)將閾值選定在各對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線平行上升的最低點(diǎn)，獲得各反應(yīng)管的Ct值，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系，公式如下：ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(參照基因)]實(shí)驗(yàn)組-[Ct(目的基因)-Ct(參照基因)]對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.8Westernblot檢測(cè)NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)情況提取各組大鼠心肌組織和各組細(xì)胞蛋白，按BCA試劑盒(武漢博士德公司)說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度，將提取的蛋白加入上樣緩沖液后在95 ℃煮10 min，每孔上樣30 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠(武漢博士德公司)電泳分離蛋白，電泳電壓80 V轉(zhuǎn)120 V，濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜電壓 100 mV，時(shí)間 45～70 min，PVDF 轉(zhuǎn)膜，5% BSA室溫封閉1 h，加入兔抗鼠一抗NLRP3(1 ∶1 000稀釋)、caspase-1(1 ∶1 000稀釋)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，抗鼠一抗β-actin(1 ∶3 000稀釋)購(gòu)自美國(guó)BD公司，4 ℃過(guò)夜。TBST 漂洗3次，每次5 min，相應(yīng)的羊抗兔二抗(上海妙通生物科技公司)室溫孵育 1 h，洗膜，洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光試劑顯影。β-actin作為內(nèi)參。Bio-rad Gel Dol EZ 成像儀(GEL DOC EZ IMAGER，美國(guó)Bio-rad公司)顯影。目的條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.9MTT法檢驗(yàn)細(xì)胞活性將2～3代CMEC細(xì)胞懸液按一定濃度稀釋細(xì)胞數(shù)后以5×104每孔密度接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)平行孔。待細(xì)胞達(dá)80%融合后，按上述實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，復(fù)氧結(jié)束后，再加入MTT液(美國(guó)Sigma公司)20 μl，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，棄MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)150 μl，搖床振蕩10 min后于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均OD值。細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/空白組OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.10Hochest33258染色檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡使用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，離心后的細(xì)胞置于完全培養(yǎng)液中重懸，在24孔板中以500 μl(6×105/孔)密度接種于，37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育。待細(xì)胞貼壁融合后，取出蓋玻片，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，然后PBS洗3次，每次5 min。Hochest 33258工作液25 ℃染色5 min，蒸餾水沖凈晾干。在倒置熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇高倍鏡視野5個(gè)/組，固縮、濃集、細(xì)胞核變亮認(rèn)為是凋亡細(xì)胞核，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。凋亡率等于陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)之比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.11ELISA檢測(cè)白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-10和IL-18水平0.25%胰酶-0.02%EDTA消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液重懸，以500 μl(6×105/孔)密度接種于24孔板，37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育。待細(xì)胞貼壁融合后，收集細(xì)胞上清液。上清液保存于-20 ℃的環(huán)境中，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清中的IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18的濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

2　結(jié)果

2.1大鼠的血脂和血鈣的濃度變化檢測(cè)大鼠的血脂和血鈣的濃度結(jié)果顯示：與正常組大鼠比較，AS組大鼠血清TC、TG、LDLC水平均明顯升高(P<0.05)，HDLC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，AS組大鼠血清中Ca2+濃度明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2大鼠心肌組織中miR-22和NLRP3、caspase-1mRNA表達(dá)水平經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中miR-22水平和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)情況，兩組大鼠miR-22水平和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平存在顯著差異(t=26.84、64.01、50.59，P<0.05)。 與正常組比較AS組大鼠心肌組織中miR-22水平顯著下調(diào)，而NLRP3和caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　大鼠心肌組織中miR-22和NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)水平

2.3大鼠心肌組織中NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平Western blot法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)水平，各組間NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=120.70、50.21，P<0.05)。與正常組比較，AS組的NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

表1　各組大鼠血清血脂和血鈣水平

與正常組比較：*P<0.05

圖2　大鼠心肌組織蛋白表達(dá)水平

2.4雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)生物信息學(xué)軟件http://www.microrna.org預(yù)測(cè)miR-22 與NLRP3有靶向關(guān)系(圖3A)。293T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染NLRP3-3′UTR-WT質(zhì)粒和miR-22模擬物質(zhì)粒，結(jié)果顯示，野生型中，與NLRP3-3′UTR-WT+NC組比較， NLRP3-3′UTR-WT+ miR-22 mimic組熒光素酶活性顯著降低(t=5.26，P<0.05)。而突變型中，與NLRP3-3′UTR-MUT+NC組比較，共轉(zhuǎn)染NLRP3-3′UTR-MUT+miR-22 mimic質(zhì)粒后，熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。

2.5冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)觀察及鑒定原代CMECs培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，可見(jiàn)細(xì)胞呈單層鵝卵石狀生長(zhǎng)，小而短梭形，胞體具有較好的折光度。貼壁細(xì)胞數(shù)量隨著細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)增加越來(lái)越多，細(xì)胞開(kāi)始伸展并呈梭形貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)至5～7 d時(shí)，細(xì)胞呈多角形或梭形(圖4)。傳代細(xì)胞3～4 h后可生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)與原代培養(yǎng)細(xì)胞相同，呈現(xiàn)典型“鋪路石樣結(jié)構(gòu)”。 同時(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示內(nèi)皮細(xì)胞的特異分子標(biāo)志CD34、CD105、Tie-2因子呈強(qiáng)陽(yáng)性，CD31、vW因子呈陽(yáng)性。

圖3　miR-22 與NLRP3的靶向關(guān)系驗(yàn)證

A：在線軟件預(yù)測(cè)靶向關(guān)系圖；B：熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果；與NLRP3-3′UTR-WT中的NC組比較：*P<0.05

圖4　CMECs形態(tài)觀察　×200

2.6各組細(xì)胞中miR-22和NLRP3、caspase-1mRNA表達(dá)水平實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，miR-22 mimic組miR-22水平顯著上升，NLRP3、caspase-1的mRNA表達(dá)水平顯著下降；而miR-22 inhibitor組的miR-22水平顯著下降，NLRP3、caspase-1的mRNA表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.53、258.10、440.60，P<0.05)?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-22 inhibitor+si NLRP3組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

圖5　各組細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

2.7各組細(xì)胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)水平Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中NLRP3、caspase-1 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，miR-22 mimic組NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)水平顯著下降；而miR-22 inhibitor組的NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.50、41.75,P<0.05)?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-22 inhibitor+si NLRP3組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖6。

2.8各組細(xì)胞活性MTT法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組比較，miR-22 mimic細(xì)胞活性顯著升高；miR-22 inhibitor組細(xì)胞活性則顯著降低(P<0.05)。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-22 inhibitor + si NLRP3組細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖7。

2.9Hochest33258染色結(jié)果Hochest 33258染色結(jié)果顯示：細(xì)胞進(jìn)行冠心病應(yīng)激后，出現(xiàn)細(xì)胞核不完整，核固縮，染色質(zhì)濃集和凋亡小體等典型的凋亡特征。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組比較，miR-22 mimic組細(xì)胞核不完整的細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞凋亡率明顯下降；而miR-22 inhibitor組細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核不完整的細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05)。miR-22 inhibitor+si NLRP3組的凋亡率與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖8。

圖6　各組細(xì)胞蛋白條帶圖和各組蛋白表達(dá)水平

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：miR-22 mimic組；4：miR-22 inhibitor組；5：miR-22 inhibitor + si NLRP3組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

圖7　MTT法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活性

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：miR-22 mimic組；4：miR-22 inhibitor組；5：miR-22 inhibitor + si NLRP3組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

2.10細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平經(jīng)ELISA法檢驗(yàn)表明：與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，miR-22 mimic組IL-1β、IL-6和IL-18分泌量明顯降低，IL-10分泌顯著升高；而miR-22 inhibitor組IL-1β、IL-6和IL-18分泌量明顯增加，而IL-10分泌顯著下調(diào)(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組及miR-22 inhibitor + si NLRP3組之間比較，IL-1β、IL-6、IL-10和IL-18分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

圖8　各組細(xì)胞的凋亡染色圖檢測(cè)　×200

A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：miR-22 mimic組；D：miR-22 inhibitor組；E：miR-22 inhibitor + si NLRP3組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

表2　各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05；與miR-22 mimic組比較：#P<0.05

3　討論

據(jù)2010全球疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告分析，冠心病是當(dāng)今影響全球死亡病例與入院治療人群的主要原因之一。本研究顯示miR-22通過(guò)靶向抑制NLRP3基因，減少冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及下調(diào)促炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

首先，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，AS組大鼠心肌組織中miR-22水平顯著下調(diào)，而NLRP3和caspase-1表達(dá)水平顯著上調(diào)。NLRP3炎性體是目前結(jié)構(gòu)和功能最為明確的炎性體之一，也是NLR家族的重要成員之一，主要由NLRP3、caspase-1和凋亡相關(guān)微粒蛋白(ASC)組成。NLRP3炎性體在動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊中被激活，并且在冠心病患者主動(dòng)脈中存在著過(guò)度表達(dá)，其表達(dá)水平與冠心病的嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。經(jīng)過(guò)雙熒光素梅檢測(cè)報(bào)告驗(yàn)證，NLRP3是miR-22的靶向基因。與空白對(duì)照組比較，miR-22 mimic組NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平顯著下降，而miR-22 inhibitor組的NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平顯著上升。本研究結(jié)果顯示miR-22過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力，并使細(xì)胞凋亡率下降。因此，miR-22可靶向抑制NLRP3減少冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

與此同時(shí)，NLRP3炎癥小體在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，被激活的NLRP3炎癥小體，誘發(fā)caspase-1活化，進(jìn)而促進(jìn)白介素1β前體(pro-IL-1β)及pro-IL-18的成熟和分泌[12]。動(dòng)脈硬化過(guò)程中，磷酸鈣結(jié)晶體激活caspase-1，巨噬細(xì)胞中釋放炎性因子IL-1β和IL-1α，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[13]。與本研究結(jié)果一致，本研究顯示miR-22 mimic組的IL-1β、IL-6和IL-18炎癥因子表達(dá)水平下調(diào)。目前所知的IL-1家族一共包括了11個(gè)成員，IL-1α、IL-1β、IL-1 receptor agonist (IL-Ra)、IL-18、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1F10與IL-33[14]。IL-1β通過(guò)結(jié)合IL-1受體1，是重要的炎癥信號(hào)之一[15]。由此，可得出結(jié)論，miR-22通過(guò)靶向抑制NLRP3基因下調(diào)促炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)，減輕細(xì)胞炎癥損傷。

綜上，本研究顯示miR-22通過(guò)靶向抑制NLRP3基因，減少冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，下調(diào)促炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)，從而保護(hù)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷。這一發(fā)現(xiàn)或許會(huì)為冠心病的臨床治療提供一個(gè)新的研究方向。然而，該發(fā)現(xiàn)尚未得到臨床數(shù)據(jù)的支持，因此接下來(lái)將進(jìn)一步研究miR-22應(yīng)用于冠心病的臨床治療的作用與分子機(jī)制。