復(fù)合神經(jīng)營養(yǎng)因子—3的靜電紡絲高分子材料促進(jìn)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化

張善強 李永濤 包鑫 李宇 姚立杰 鄧鳳春 金海峰 沈雷

[摘要] 目的 探討以靜電紡絲技術(shù)制備的聚乳酸-羥基乙酸共聚物/-磷酸三鈣 （PLGA/-TCP）高分子材料與兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSC）的生物相容性，并研究rBMSC在復(fù)合神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）的PLGA/-TCP支架材料上的增殖與分化情況。 方法 選取齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)研究室于2016年7月購買的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。在正常條件下，單獨培養(yǎng)的rBMSC為對照組；將rBMSC種植在PLGA/-TCP支架材料上為PT組；以100 ng/mL重組NT-3蛋白刺激的PT組為NT-3/PT組，各組均行成骨誘導(dǎo)實驗21 d。利用CCK-8實驗于成骨誘導(dǎo)第2、7、14、21天檢測各組rBMSC增殖情況；ELISA實驗檢測各組rBMSC的堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（BMP-1）及核心結(jié)合因子a-1（Cbfa-1）等蛋白含量。結(jié)果 相對于PT組，NT-3/PT組的細(xì)胞增殖OD值在2 d（0.392±0.027）、7 d（0.594±0.024）、14 d（0.978±0.089）、21 d（1.124±0.045）均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）； NT-3/PT組的ALP、BMP-1及Cbfa-1等蛋白含量[（1.525±0.352），（1.678±0.102），（1.104±0.076）pg/mL]均高于PT組[（1.154±0.741），（1.321±0.131），（0.852±0.067）pg/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 復(fù)合NT-3的PLGA/-TCP靜電紡絲高分子材料有效促進(jìn)MSC增殖和向成骨細(xì)胞分化。

[關(guān)鍵詞] 神經(jīng)營養(yǎng)因子-3；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；-磷酸三鈣；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；靜電紡絲

[中圖分類號] R392.12 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）02（a）-0009-05

Electrospinning of Compound Neurotrophic Factor-3 Promotes Proliferation and Differentiation of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

ZHANG Shan-qiang1， LI Yong-tao1， BAO Xin2， LI Yu1， YAO Li-jie1， DENG Feng-chun1， JIN Hai-feng1， SHEN Lei1

1.Department of Anatomy， Basic Medical Institute of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China； 2.Information Reference Department， Qiqihar University Library， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the biocompatibility of poly （DL-lactic-co-glycolic acid） / tricalcium phosphate （TCP-TCP） prepared by electrospinning with rabbit bone marrow mesenchymal stem cells （rBMSC） Proliferation and Differentiation on PLGA / -TCP Scaffolds with Nerve Trophoblast-3 （NT-3）. Methods Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells purchased by anatomical research laboratory of Qiqihar medical college in July 2016 were selected. Under the normal situation， the rBMSC cultured alone as control group； the rBMSC implanted into the PLGA/-TCP polymeric material as PT group； the PT group stimulated by 100 ng/mL NT-3 recombination protein as NT-3/PT group， each group was subjected to osteogenic induction for 21 days. The CCK-8 assay was used to detect the proliferation of rBMSC on 2， 7， 14 and 21 d of osteogenic induction experiment in each group； ELISA experiment was used to detect the contents of alkaline phosphatase （ALP）， bone morphogenetic protein-1（BMP-1）， and core binding factor a 1（Cbfa-1） in each group. Results Compared with PT group， the cell proliferation OD values of NT-3/PT group were significantly elevated in 2 d（0.392±0.027）， 7 d （0.594±0.024）， 14 d （0.978±0.089）， 21 d （1.124±0.045）， the difference was statistically significant（P<0.01）； the contents of ALP， BMP-1 and Cbfa-1 protein in NT-3/PT group [（1.525±0.352），（1.678±0.102；），（1.104±0.076）pg/mL] were higher than those in PT group [（1.154±0.741），（1.321±0.131），（0.852±0.067）pg/mL]， and the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion The electrospun polymeric material combined with neurotrophin-3 effectively promote rBMSC proliferation and osteogenic differentiation.

[Key words] Neurotrophin-3（NT-3）； Poly lactic-co-glycolic-acid copolymer （PLGA）； -Tricalcium phosphate （-TCP）； Bone marrow mesenchymal stem cell （BMSC）； Electrospinning

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cell， BMSC）是來源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點，是目前骨組織工程治療骨缺損疾病的理想種子細(xì)胞[1]。研究發(fā)現(xiàn)，生物活性因子對細(xì)胞的生長與分化功能影響顯著，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（Neurotrophin-3， NT-3）可有效促進(jìn)MSC增殖與成骨分化，并刺激MSC分泌VEGF、bFGF等因子加速局部組織血管的重建[2]。但是，在治療大面積骨缺損時，還需要有適宜的載體為細(xì)胞生長、增殖和分化提供穩(wěn)定的環(huán)境，同時利用支架材料的可降解性與緩釋作用，使外源性因子在較長時間內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用[3]。研究證實，聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid copolymer， PLGA）具有良好的降解性與生物相容性，已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料。但此類聚合物存在親水性差、細(xì)胞吸附性能低、降解產(chǎn)生有機酸和引起無菌性炎癥反應(yīng)等缺點[4]。-磷酸三鈣（-tricalcium phosphate， -TCP）植入機體后反應(yīng)溫和，基本不放熱，降解后被生物體迅速吸收和取代，可彌補PLGA的不足[5]。因此，通過合適的方法把兩種或多種材料復(fù)合是彌補單一材料作為細(xì)胞載體不足的有效措施。該次已利用靜電紡絲技術(shù)成功制備出PLGA/-TCP支架材料[6]。該實驗擬在體外將rBMSC接種于具有緩釋NT-3作用的復(fù)合材料，通過21 d成骨誘導(dǎo)實驗研究細(xì)胞的增殖和成骨活性，為組織工程修復(fù)骨損傷提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（RBXMX-90011）、胰蛋白酶-EDTA（TEDTA-10001）、磷酸鹽緩沖液（PBS-10001）。α-MEM培養(yǎng)基（SH30265.01B）、胎牛血清（FBS）（SH300 71.03）、青霉素（K0035）、鏈霉素（K0035）。六氟異丙醇（HFIP）（YBH107501）、PLGA（430471）和-TCP（RC024 70A）。地塞米松（50-02-2）、L-抗壞血酸（PV0001）、-甘油磷酸鈉（50020）、L-谷氨酰胺（G8540-100G）。CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒（CK04）。神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）重組蛋白（P20783）。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）（PRD1061）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（Bone morphogenetic protein-1， BMP-1）（E-EL-RB0531）、核心結(jié)合因子a 1（core binding factor a 1， Cbfa-1）（E-EL-RB15 41c）的酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）。Emax 酶標(biāo)儀，SS-2535DC靜電紡絲機。

1.2 方法

1.2.1 PLGA/-TCP支架材料 HFIP溶解80% PLGA和20%TCP，制備了重量比為5 %的PLGA/-TCP聚合物溶液。聚合物靜電紡絲工藝參數(shù)為電場強度21 kV，噴絲孔直徑為0.4 mm，電極間距為10 cm，紡絲速度為0.4 mL/h。制備支架厚度為0.9～1.1 mm。靜電紡絲高分子材料反復(fù)浸泡在含雙抗的0.01 mmol/L PBS溶液中。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組 rBMSC以含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、1 μmol/L青霉素和100 U/mL鏈霉素的α-MEM基本培養(yǎng)基培養(yǎng)。若α-MEM基本培養(yǎng)基含100 μmmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗壞血酸C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉則為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

5×104/mL rBMSC接種于PLGA/-TCP靜電紡絲材料上，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，設(shè)為PT組；在PT組基礎(chǔ)上，以100 ng/mL兔NT-3重組蛋白刺激的為NT-3/PT組；單獨培養(yǎng)的rBMSC為對照組。各組均行成骨誘導(dǎo)實驗21 d，每2 d換液1次。

1.2.3 CCK-8實驗檢測各組細(xì)胞增殖 按照實驗分組情況，將PLGA/-TCP靜電紡絲材料置于培養(yǎng)板內(nèi)，將1×104 rBMSC接種于材料上。對照組按1×104/孔接種于96孔板中，然后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)。分別于實驗第2、7、14、21天棄掉原培養(yǎng)基，加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用Emax酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測各組樣品吸光度值（OD值）。

1.2.4 ELISA實驗檢測各組相關(guān)蛋白濃度 2×105成骨誘導(dǎo)21 d的各組細(xì)胞，以含1%FBS的α-MEM培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，收集各實驗組上清液，使用ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞中ALP、BMP-1及Cbfa-1蛋白含量，實驗程序按說明書執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計方法

所有實驗均至少重復(fù)3次，使用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析， 計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組rBMSC增殖結(jié)果

對各組細(xì)胞增殖OD值行方差分析，NT-3/PT組的細(xì)胞增殖OD值最明顯，與PT組相比，NT-3/PT組的細(xì)胞增殖OD值在實驗第2、7、14、21天逐漸增高，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.2 各組rBMSC的ALP、BMP-1、Cbfa-1蛋白含量

通過方差分析各組ALP、BMP-1、Cbfa-1蛋白含量，相對于PT組，NT-3/PT組的ALP、BMP-1、Cbfa-1蛋白含量均明顯增高，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）

3 討論

目前，應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損主要依賴3個關(guān)鍵因素，即血管源性細(xì)胞、外源性生長因子和支架材料。來源于骨髓的MSC是最早被發(fā)現(xiàn)的多能干細(xì)胞，可在體內(nèi)或體外特定環(huán)境下誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，并因具有造血支持和自我增殖等特點，已成為組織工程修復(fù)組織器官損傷的首先種子細(xì)胞[7]。在骨缺損的修復(fù)過程中，損傷區(qū)域的血液循環(huán)是促進(jìn)治療效果的關(guān)鍵因素。血管化的建立不僅可以為植入的細(xì)胞和周圍組織提供充足的氧分與營養(yǎng)，還可減輕植入材料時產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。但是，單純地移植MSC或使用骨誘導(dǎo)性材料并不能在短期內(nèi)誘導(dǎo)血管發(fā)生，如果血管形成不足，局部受損組織缺乏營養(yǎng)，就會導(dǎo)致MSC分化不一致甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。

近來，有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)與血管的發(fā)生發(fā)育密不可分，神經(jīng)營養(yǎng)因子在調(diào)控血管生長方面發(fā)揮重要作用。NT-3是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，在前期實驗中，發(fā)現(xiàn)NT-3可有效促進(jìn)MSC增殖，并通過MSC旁分泌作用，增強VEGF、bFGF等血管再生因子的表達(dá)，招募血管內(nèi)皮細(xì)胞歸巢，加速糖尿病性皮膚潰瘍的修復(fù)[2]。但是，生物活性因子在體內(nèi)半衰期短，易被體液稀釋，難以保持局部的有效治療濃度。因此，開發(fā)具有降解性和緩釋作用的支架材料就成為促進(jìn)MSC療法和發(fā)揮生物活性因子持續(xù)作用的熱點研究。

PLGA因具有良好的降解性與生物相容性，已被組織工程廣泛應(yīng)用于支架材料、藥物緩釋載體等方面。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合MSC的PLGA支架材料雖具備一定的骨修復(fù)作用，但該類材料表面缺乏細(xì)胞識別信號，很難與細(xì)胞發(fā)生相互作用[9]。與PLGA相比，-TCP具有更高的骨誘導(dǎo)性和降解率，其獨特的晶形結(jié)構(gòu)在局部降解時可產(chǎn)生高濃度的鈣、磷等離子，易于在人工骨中形成類骨磷灰石[10]。因此，通過對材料的優(yōu)化與整合，制備了PLGA/-TCP支架材料。

在該實驗中，將rBMSC植入PLGA/-TCP，并在成骨誘導(dǎo)實驗第2、7、14、21天分別檢測了各組rBMSC的增殖情況，結(jié)果顯示PT組的細(xì)胞增殖OD值[（0.352±0.035），（0.514±0.057），（0.893±0.027），（0.953±0.075）]與對照組[（0.341±0.034），（0.423±0.011），（0.752±0.054），（0.852±0.049）]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明PLGA/-TCP與rBMSC具有良好的生物相容性。楊文峰[11]等人的研究也發(fā)現(xiàn)，利用靜電紡絲制備的PLGA支架材料的纖維直徑（470～620 nm）與天然細(xì)胞外基質(zhì)纖維直徑（50～500 nm）十分相近，具有適合細(xì)胞生存及增殖的環(huán)境。NT-3/PT組的細(xì)胞增殖OD值在實驗2 d（0.392±0.027）、7 d（0.594±0.024）、14 d（0.978±0.089）、21 d（1.124±0.045）穩(wěn)定持續(xù)增加，并明顯高于PT組，說明PLGA/-TCP對NT-3具有良好的緩釋調(diào)控作用。ALP、BMP-1、Cbfa-1等是檢測MSC向成骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)，該次的實驗發(fā)現(xiàn)PT組和對照組的ALP、BMP-1、Cbfa-1[PT組：（1.154±0.741），（1.321±0.131），（0.852±0.067）pg/mL；對照組：（0.764±0.542），（0.852±0.461），（0.686±0.045）pg/mL]等蛋白表達(dá)均無明顯差異，證明PLGA/-TCP具有良好的骨誘導(dǎo)性[9-10]。NT-3/PT組ALP、BMP-1、Cbfa-1等蛋白含量[（1.525±0.352），（1.678±0.102），（1.104±0.076）pg/mL]明顯高于PT組，說明PLGA/-TCP復(fù)合NT-3能加快rBMSC向成骨細(xì)胞分化，理論上達(dá)到可縮短骨修復(fù)過程的指標(biāo)。

綜上所述，利用體外實驗觀察NT-3與PLGA/-TCP對rBMSC的生長和分化的影響。證明復(fù)合NT-3的PLGA/-TCP具備較高的生物相容性，并可有效促進(jìn)MSC增殖與分化。下一步，可以將攜帶緩釋NT-3的PLGA/-TCP的人工骨質(zhì)材料植入動物模型中，利用動物體內(nèi)實驗評價生物材料對骨缺損修復(fù)的作用及血管形成的影響。

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（收稿日期：2017-11-07）