miR-132-3p靶向的重力敏感長鏈非編碼RNAs的篩選及調(diào)控探討

王 可，胡澤兵，王藝璇，張麗君，曹新生，石 菲，張 舒

空軍軍醫(yī)大學航空航天生物動力學教研室，航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，陜西西安 710032

隨著我國載人航天事業(yè)逐漸向中長期航天飛行階段邁進，航天失重環(huán)境引起的骨質(zhì)丟失問題日益受到人們關注。在航天飛行過程中，暴露于外太空失重環(huán)境下的航天員會出現(xiàn)骨密度減少、骨質(zhì)脫鈣、骨組織結構改變和生物力學性能降低等情況，且隨著時間的延長以上癥狀持續(xù)加重[1-3]。骨骼是動態(tài)變化的器官，在生長、發(fā)育過程中，骨骼系統(tǒng)持續(xù)存在舊骨吸收、新骨生成的生理活動以維持骨骼在長度及質(zhì)量上的穩(wěn)定，即稱為骨自穩(wěn)態(tài)[4]。研究顯示，失重導致的骨質(zhì)丟失，成骨細胞介導的骨形成功能障礙是主要原因，但失重性骨質(zhì)丟失的確切分子機制尚未完全闡明[5]。目前，對于非編碼RNA的研究正如火如荼地展開，其中miRNA在失重性骨丟失過程中的重要作用已被廣泛證實[6-9]。我們課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，模擬失重環(huán)境下miR-132-3p顯著上調(diào)，并通過抑制EP300影響Runx2的乙酰化與蛋白活性從而對成骨分化起到負性調(diào)控作用，進而引起骨質(zhì)丟失[10]。然而，長度＞200 bp的長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)在失重性骨丟失中的作用卻未見報道。已有研究表明，lncRNAs可通過堿基互補配對原則與mRNA競爭性結合miRNA，從而抑制了miRNA對靶mRNA的調(diào)控作用[11]，進而形成精確調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)揮生物學效應。為了尋找可能在失重性骨丟失中發(fā)揮作用的lncRNAs，我們基于前期對于重力敏感miR-132-3p研究的基礎上，初步篩選出3條與miR-132-3p有結合位點并且具有重力敏感性的lncRNA NONMMUT010777、NONMMUT-016978和NONMMUT027831，證實其在誘導MC3T3-E1細胞分化過程中與miR-132-3p的表達呈負相關，并且miR-132-3p可調(diào)控lncRNANONMMUT010777表達，從而為lncRNAs在失重性骨丟失中的作用研究提供了依據(jù)。

材料和方法

1 材料 小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1(購于ATCC細胞庫)，胎牛血清(四季青公司)，DMEM培養(yǎng)基、雙抗(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Millipore公司)，miRNA-132-3p Mimic、Inhibitor及相關對照(廣州銳博生物科技有限公司)，RNAiso細胞裂解液、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script?RT reagent Kit和SYBR?Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，2D-RWVs型回轉(zhuǎn)器(中國航天員科研訓練中心)；qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

2 細胞培養(yǎng) 將凍存的小鼠前成骨細胞MC3T3-E1細胞復蘇后，使用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細胞置于37℃孵箱中，維持5% CO2濃度，每2 d換液1次。當細胞的匯合度達到90%左右時，使用胰蛋白酶進行傳代培養(yǎng)。選取3 ～ 6代呈對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

3 回轉(zhuǎn)器模擬失重 在超凈臺中將細胞傳代至回轉(zhuǎn)瓶，放入37℃孵箱常規(guī)培養(yǎng)。傳代6 ～ 8 h后細胞完全貼壁，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基灌滿回轉(zhuǎn)瓶，直立放于37℃孵箱培養(yǎng)過夜。第2天在超凈臺中完全排盡回轉(zhuǎn)瓶中的氣泡?；剞D(zhuǎn)組安裝于2D回轉(zhuǎn)器上垂直回轉(zhuǎn)，回轉(zhuǎn)半徑為1.5 cm，轉(zhuǎn)速均為24 r/min；對照組置于37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)?；剞D(zhuǎn)時間為48 h。測量72 h內(nèi)變化時加測24 h與72 h組?；剞D(zhuǎn)完成后根據(jù)后續(xù)實驗所需提取細胞樣本進行檢測。

4 誘導成骨分化 MC3T3-E1細胞中加入成骨誘導液(含10%胎牛血清、1%雙抗、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松、50μg/ml維生素C的DMEM培養(yǎng)基)，誘導培養(yǎng)7 d后根據(jù)后續(xù)實驗所需提取細胞樣本進行檢測。

5 細胞轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染。首先將合成的miR-132-3p Mimic、Inhibitor干凍粉劑以DEPC水稀釋溶解，分裝備用(20μmol/L)。將細胞以適當密度鋪6孔板，所用培養(yǎng)基更換為無雙抗的DMEM誘導培養(yǎng)基，當其生長到約70%融合度時準備進行轉(zhuǎn)染。無血清Opti-MEM培養(yǎng)基 250μl中加入 Lipofectamine2000脂質(zhì)體 4μl。再次吸取無血清Opti-MEM培養(yǎng)基250μl分別加入各Mimic、Mimic-NC稀釋存儲液(4μl)及Inhibitor、Inhibitor-NC稀釋存儲液(10μl)，靜置5 min。然后將兩者混勻后再靜置20 ～ 30 min。最后將各組配好的轉(zhuǎn)染液體分別加入隨機分配標記的6孔板中，再向每孔中加入1 500μl無血清、無雙抗的DMEM誘導培養(yǎng)基。6 ～ 8 h后換有血清、無雙抗的DMEM誘導培養(yǎng)基。24 h后提取細胞總RNA。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

6 實時熒光定量PCR 使用RNAiso Plus提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，PCR擴增采用SYBR Green熒光染料法，PCR引物序列見表1。miRNA檢測：采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit合成cDNA。以合成的cDNA為模版，以U6為內(nèi)參擴增miRNA。lncRNA檢測：采用PrimeScript?RT Master Mix reagent Kit合成cDNA。以合成的cDNA為模版，以GAPDH為內(nèi)參擴增lncRNA。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行相對定量分析。

7 統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以-x±s表示。先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分析和方差齊性檢驗。兩樣本間比較采用獨立樣本t檢驗；多樣本組間兩兩比較分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；樣本不同時間點多次測量的結果比較分析采用重復測量方差分析(Repeated-Measures ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 生物信息學預測與miR-132-3p有結合位點的6條lncRNAs 基于課題組前期研究[10]，為了進一步尋找miR-132-3p靶向的lncRNAs，我們使用miRanda預測出了6條與miR-132-3p有結合位點的 lncRNAs(表 2)。

2 模擬失重致MC3T3-E1細胞lncRNAs表達下調(diào)為了篩選對重力變化敏感的lncRNAs，我們將MC3T3-E1細胞放入2D回轉(zhuǎn)器模擬失重條件培養(yǎng)48 h，采用qRT-PCR技術檢測lncRNAs的表達。結果顯示模擬失重組與對照組相比，lncRNA NONMMUT010777(P＜0.05)、NONMMUT016978(P＜0.05)和NONMMUT027831(P＜0.01)的表達顯著下調(diào)，而另3條lncRNAs表達未出現(xiàn)顯著變化(圖1)。

表2 miRanda預測與miR-132-3p有結合位點的lncRNAsTab. 2 Six candidate lncRNAs targeted by miR-132-3p screened out by miRanda

圖1 模擬失重后MC3T3-E1細胞lncRNAs的表達變化(aP＜0.05，bP＜0.01， vs 對照組)Fig. 1 Expression levels of lncRNAs in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity (aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

3 模擬失重72 h內(nèi)MC3T3-E1細胞lncRNAs的表達變化 為進一步了解重力敏感l(wèi)ncRNAs在模擬失重環(huán)境下的變化特點，我們采用qRT-PCR方法檢測了MC3T3-E1細胞中l(wèi)ncRNA NONMMUT 010777、NONMMUT016978和 NONMMUT027831在模擬失重72 h內(nèi)的表達變化。結果顯示，與對照組相比，lncRNAs在模擬失重24 h后即出現(xiàn)顯著下調(diào)，且顯著下調(diào)變化至少可持續(xù)至72 h(P＜0.01或P＜ 0.05)。 表 明 lncRNA NONMMUT010777、NONMMUT016978和NONM-MUT027831在模擬失重處理72 h內(nèi)呈穩(wěn)定下調(diào)趨勢(圖2)。

圖2 模擬失重72 h內(nèi)MC3T3-E1細胞中重力敏感l(wèi)ncRNAs的表達變化(aP＜0.05， bP＜0.01， vs 對照組)Fig. 2 Expression levels of microgravity-sensitive lncRNAs in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity for 24, 48 and 72 h (aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

4 誘導培養(yǎng)MC3T3-E1細胞后miR-132-3p與lncRNAs表達呈負相關 前期研究已充分證實了miR-132-3p在模擬失重環(huán)境下對成骨分化的抑制作用[10]，為了進一步探討miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在成骨分化過程中與miR-132-3p表達的相關性，我們向MC3T3-E1細胞中加入成骨誘導液誘導培養(yǎng)7 d，然后采用qRT-PCR方法檢測lncRNAs和miR-132-3p的表達變化。結果顯示，與對照組相比，誘導分化后miR-132-3p表達顯著下調(diào)，而lncRNA NONMMUT010777(P＜0.01)、NONMMUT016978(P＜0.01)和NONMMUT-027831(P＜0.05)表達均顯著上調(diào)(圖3)。結果顯示誘導分化過程中miR-132-3p與其靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs的表達呈負相關，提示miR-132-3p可能調(diào)控lncRNAs的表達。

5 miR-132-3p可調(diào)控lncRNAs的表達 為了驗證誘導分化過程中miR-132-3p對其靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs的調(diào)控作用，我們向誘導分化的MC3T3-E1細胞中轉(zhuǎn)染了miR-132-3p的Mimic或Inhibitor，并采用qRT-PCR方法檢測了轉(zhuǎn)染后miR-132-3p的表達水平以驗證轉(zhuǎn)染效果，然后檢測lncRNAs的表達水平。結果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，mimic-132組的miR-132-3p表達量較對照組升高了約150倍(P＜0.01)，而inhibitor-132組表達量較對照組下降了約70%(P＜0.01)。過表達或抑制miR-132-3p后，在3條重力敏感的lncRNAs中，NONMMUT010777的表達顯著下調(diào)或上調(diào)(P＜0.01)，而NONMMUT016978和NONMMUT027831的表達無顯著改變(圖4)。提示在誘導分化過程中miR-132-3p可調(diào)控lncRNA NONMMUT010777的表達。

圖3 誘導分化后MC3T3-E1中miR-132-3p和lncRNAs的表達變化(aP＜0.05， bP＜0.01, vs 對照組)Fig. 3 Expression levels of lncRNAs and miR-132-3p in MC3T3-E1 cells under osteogenic induction (aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

討 論

圖4 miR-132-3p轉(zhuǎn)染效果以及miR-132-3p對lncRNAs表達水平的影響(aP＜0.05， bP＜0.01, vs 對照組)Fig. 4 Transfection effects of miR-132-3p and expression levels of lncRNAs in MC3T3-E1 cells transfected with mimics, inhibitors and negative control(aP＜0.05， bP＜0.01, vs control group)

為了篩選miR-132-3p靶向的具有重力敏感性的lncRNAs，本實驗使用miRanda預測出了6條與miR-132-3p有結合位點的lncRNAs，并使用2D回轉(zhuǎn)器處理MC3T3-E1細胞模擬失重效應，發(fā)現(xiàn)6條lncRNAs中有3條表達下調(diào)，并進一步證實了這3條lncRNAs在模擬失重處理72 h內(nèi)穩(wěn)定下調(diào)。此外，為了進一步探討miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在成骨分化過程中與miR-132-3p表達的相關性，我們使用成骨誘導液誘導MC3T3-E1細胞分化7d后，miR-132-3p表達下調(diào)，3條重力敏感l(wèi)ncRNAs表達上調(diào)。此外向誘導分化的MC3T3-E1細胞中轉(zhuǎn)染miR-132-3p Mimic和Inhibitor，發(fā)現(xiàn)在3條重力敏感l(wèi)ncRNAs中，NONMMUT010777出現(xiàn)明顯表達下調(diào)或上調(diào)，而另外兩條未出現(xiàn)明顯表達變化。結果提示miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在誘導MC3T3-E1細胞分化過程中與miR-132-3p的表達呈負相關，并且miR-132-3p可調(diào)控lncRNANONMMUT010777表達。

骨骼是動態(tài)變化的器官，其依賴成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收功能維持穩(wěn)態(tài)[12]。而重力和機械力對于維持骨骼的正常形態(tài)和結構至關重要[1]。重力是一種以場力的形式作用于骨的力，是維持骨的正常生理功能狀態(tài)的重要力學刺激[5]。在航天失重環(huán)境下，骨鈣以平均每個月1% ～ 2%的速率丟失，且沒有自限性，這成為制約人類長時程航行的主要醫(yī)學問題[13]。然而，失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生機制尚未闡明。但有研究表明，破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成的平衡紊亂，是引起失重性骨質(zhì)丟失的主要原因[14]。

LncRNAs是在真核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類長度＞200 nt、沒有長閱讀框架，但往往具有mRNA結構特征(5'帽式結構和polyA尾巴)的RNA[15]。LncRNAs可通過順式作用直接調(diào)控鄰近基因表達和反式作用調(diào)控遠距離基因表達的方式[16]，在成骨分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[17-19]。在lncRNAs眾多的作用機制中，其作為ceRNA和miRNAs相互調(diào)控進而發(fā)揮生物學功能日益受到關注[20]。一方面，lncRNAs可作為海綿或誘餌，通過堿基互補配對原則與miRNAs結合，或促進miRNAs的降解；另一方面，miRNAs可誘導lncRNAs降解，或只是單純結合，而不降解lncRNAs[21-25]。為了篩選miR-132-3p靶向的具有重力敏感性的lncRNAs，本實驗通過生物信息學預測的方法，找出了與miR-132-3p有結合位點的lncRNAs。進一步實驗表明，有3條lncRNAs具有重力敏感性，且在誘導MC3T3-E1細胞成骨分化過程中表達上調(diào)。然而，向MC3T3-E1細胞中轉(zhuǎn)染miR-132-3p Mimic或Inhibitor后，只有l(wèi)ncRNANONMMUT010777表達相應下調(diào)或上調(diào)，提示miR-132-3p可能通過誘導其降解的方式發(fā)揮生物學功能。而lncRNA NONMMUT016978和NONMMUT-027831未出現(xiàn)明顯表達變化，我們推測miR-132-3p可能是通過單純結合lncRNAs，從而減少了靶mRNA與miR-132-3p結合的方式來發(fā)揮生物學功能。然而，這些miR-132-3p靶向的重力敏感l(wèi)ncRNAs在失重性骨丟失發(fā)生過程中的調(diào)控作用仍需通過功能實驗來證實，如模擬失重環(huán)境下過表達lncRNAs后對成骨細胞分化功能的影響；而miR-132-3p與lncRNAs的靶向結合關系也需要熒光素酶報告基因、RNA免疫共沉淀、RNA pull-down等實驗的進一步驗證。

相較于miRNA研究的廣泛性和系統(tǒng)性，長鏈非編碼RNA的研究則略顯滯后，人們對其功能及機制的認識尚不完善。雖然lncRNAs在各種骨骼疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用已被證實[26]，但其在失重性骨丟失領域中的研究卻鮮有報道。我們課題組在前期miRNA研究的基礎上，進一步開展了lncRNAs的研究。本研究初步篩選出了3條miR-132-3p靶向的具有重力敏感性的lncRNAs，并證實其可在誘導MC3T3-E1細胞分化過程中與miR-132-3p的表達呈負相關，且miR-132-3p可調(diào)控lncRNA NONMMUT010777表達，這為我們對lncRNAs的后續(xù)功能和機制研究提供了依據(jù)。我們相信，隨著lncRNAs對失重性骨質(zhì)丟失研究的不斷深入，未來可能通過靶向干預lncRNAs的表達來抑制失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生，進而為人類的長時程航行保駕護航。

1 Morey ER， Baylink DJ. Inhibition of bone formation during space flight［J］. Science， 1978， 201（4361）： 1138-1141.

2 Turner CH， Pavalko FM. Mechanotransduction and functional response of the skeleton to physical stress： the mechanisms and mechanics of bone adaptation［J］. J Orthop Sci， 1998， 3（6）：346-355.

3 Lang T， LeBlanc A， Evans H， et al. Cortical and trabecular bone mineral loss from the spine and hip in long-duration spaceflight［J］.J Bone Miner Res， 2004， 19（6）： 1006-1012.

4 尹鵬濱， 唐佩福， 張里程， 等. 信號素3A在骨自穩(wěn)態(tài)與骨重塑中的作用［J］. 解放軍醫(yī)學院學報， 2014， 35（12）： 1272-1274.

5 周驊， 曹新生， 胡澤兵， 等. 模擬微重力通過調(diào)節(jié)AKT磷酸化抑制前成骨細胞的增殖［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2017， 17（2）：229-232.

6 Wang X， Guo B， Li Q， et al. miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation［J］. Nat Med， 2013， 19（1）： 93.

7 Wang H， Sun Z， Wang Y， et al. miR-33-5p， a novel mechanosensitive microRNA promotes osteoblast differentiation by targeting Hmga2［J］. Sci Rep， 2016， 6 ： 23170.

8 Zuo B， Zhu J， Li J， et al. microRNA-103a Functions as a Mechanosensitive microRNA to Inhibit Bone Formation Through Targeting Runx2［J］. J Bone Miner Res， 2015， 30（2）： 330-345.

9 Sun Z， Cao X， Hu Z， et al. MiR-103 inhibits osteoblast proliferation mainly through suppressing Cav1. 2 expression in simulated microgravity［J］. Bone， 2015， 76 ： 121-128.

10 Hu Z， Wang Y， Sun Z， et al. miRNA-132-3p inhibits osteoblast differentiation by targeting Ep300 in simulated microgravity［J］. Sci Rep， 2015， 5 ： 18655.

11 Salmena L， Poliseno L， Tay Y， et al. A ceRNA hypothesis： the Rosetta Stone of a hidden RNA language?［J］. Cell， 2011， 146（3）：353-358.

12 Zamurovic N， Cappellen D， Rohner D， et al. Coordinated Activation of Notch， Wnt， and Transforming Growth Factor-β Signaling Pathways in Bone Morphogenic Protein 2-induced Osteogenesis Notch TARGET GENE Hey1 INHIBITS MINERALIZATION AND Runx2 TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY［J］. J Biol Chem， 2004， 279（36）：37704-37715.

13 Holick MF. Microgravity-induced bone loss—will it limit human space exploration?［J］. Lancet， 2000， 355（9215）： 1569-1570.

14 Lueken SA， Arnaud SB， Taylor AK， et al. Changes in markers of bone formation and resorption in a bed rest model of weightlessness［J］. J Bone Miner Res， 1993， 8（12）： 1433-1438.

15 Hung T， Chang HY. Long noncoding RNA in genome regulation ：prospects and mechanisms［J］. RNA Biol， 2010， 7（5）： 582-585.

16 Mercer TR， Dinger ME， Mattick JS. Long non-coding RNAs：insights into functions［J］. Nat Rev Genet， 2009， 10（3）： 155.

17 Wang L， Wu F， Song Y， et al. Long noncoding RNA related to periodontitis interacts with miR-182 to upregulate osteogenic differentiation in periodontal mesenchymal stem cells of periodontitis patients［J］. Cell Death Dis， 2016， 7（8）： e2327.

18 Zhuang W， Ge X， Yang S， et al. Upregulation of lncRNA MEG3 promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from multiple myeloma patients by targeting BMP4 transcription［J］.Stem Cells， 2015， 33（6）： 1985-1997.

19 Jin C， Jia L， Huang Y， et al. Inhibition of lncRNA MIR31HG Promotes Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells［J］. Stem cells， 2016， 34（11）： 2707-2720.

20 Xiao X， Zhou T， Guo S， et al. LncRNA MALAT1 sponges miR-204 to promote osteoblast differentiation of human aortic valve interstitial cells through up-regulating Smad4［J］. Int J Cardiol， 2017， 243 ：404-412.

21 Yan Y， Fan Q， Wang L， et al. LncRNA Snhg1， a non-degradable sponge for miR-338， promotes expression of proto-oncogene CST3 in primary esophageal cancer cells［J］. Oncotarget， 2017， 8（22）：35750.

22 Liang WC， Fu WM， Wang YB， et al. H19 activates Wnt signaling and promotes osteoblast differentiation by functioning as a competing endogenous RNA［J］. Sci Rep， 2016， 6 ： 20121.

23 Deng L， Yang SB， Xu FF， et al. Long noncoding RNA CCAT1 promotes hepatocellular carcinoma progression by functioning as let-7 sponge［J］. J Exp Clin Cancer Res， 2015， 34 ： 18.

24 Xing CY， Hu XQ， Xie FY， et al. Long non-coding RNA HOTAIR modulates c-KIT expression through sponging miR-193a in acute myeloid leukemia［J］. FEBS Lett， 2015， 589（15）： 1981-1987.

25 Zhu M， Liu J， Xiao J， et al. Lnc-mg is a long non-coding RNA that promotes myogenesis［J］. Nat Commun， 2017， 8 ： 14718.

26 王可， 曹新生， 石菲， 等. 長鏈非編碼RNA 調(diào)控成骨分化作用機制的研究進展［J］. 解放軍醫(yī)學院學報， 2017， 38（7）： 696-699.