小鼠LSK及DN原代細胞中基因編輯方法的建立

王躍強 Avinash Bhandoola

（1. Laboratory of Genome Integrity，Center for Cancer Research，National Cancer Institute，Bethesda，MD 20892-4254，USA ；2. 深圳國家基因庫合成與編輯平臺，深圳 518083）

小鼠免疫系統(tǒng)涉及種類眾多、功能特性各異的多種類型細胞，揭示這些免疫細胞分化發(fā)育的機制是免疫學研究的核心工作之一。在小鼠中，造血干細胞（Hematopoietic stem cells，HSC）是其他血細胞的始祖，HSC通過分化發(fā)育可以建立整個血細胞系統(tǒng)（圖1-A）［1-2］。近年來單細胞轉錄組測序和CRISPR/Cas基因編輯技術快速發(fā)展，為免疫學研究提供了新方法。如能對分離的小鼠造血干細胞實施基因編輯，再通過體內移植或體外誘導促使其分化發(fā)育；通過細胞表面抗原分析或單細胞轉錄組分析，能快捷地研究各類免疫細胞分化發(fā)育的分子機制。為此，需要建立針對造血干細胞和其他分化度較低的前體免疫細胞的基因編輯技術方法。

目前，針對人類CD34+造血干細胞（CD34+Hematopoietic stem/progenitor cell，CD34+HSPC） 實施基因編輯的報道已有多項，但針對小鼠造血干細胞實施基因編輯的研究鮮有報道。人類對CD34+HSPC的研究通常采用磁珠法，即從臍帶血或外周血中分離造血干細胞，使用電轉或病毒載體（如慢病毒載體或腺相關病毒載體）實施遺傳轉化，通過基因編輯實現(xiàn)基因治療等多種目的［3-10］。在小鼠造血干細胞中實施基因編輯僅有少量報道。2014年，Heckl等［11］從小鼠骨髓中分離LSK細胞，并使用慢病毒載體實施基因編輯敲除了Smc3、Ezh2等基因；隨后將LSK細胞移植到受體小鼠體內，在長期培養(yǎng)后構建了小鼠急性髓系白血病模型。2016年，Gundry等［4］從小鼠骨髓中分離到Kit+骨髓細胞，并通過電轉實施了基因編輯。此外，有多項報道介紹了針對樹突狀細胞、B細胞、T細胞及巨噬細胞等分化度高的免疫細胞實施基因編輯的研究成果［12-13］。相關工作極大的拓展了CRISPR/Cas技術在免疫學研究中的應用。本研究從Cas9敲入小鼠骨髓中分離得到LSK細胞，并從其胸腺中分離得到DN細胞。LSK細胞和DN細胞都是包含多種細胞類型的混合細胞。LSK細胞包含造血干細胞HSC和輕度分化的MPP細胞等，其細胞表面分子特征為Lin-、Sca1+、Kit+。DN細胞包含ETP（DN1）細胞、DN2細胞、DN3細胞和DN4細胞。針對LSK細胞和DN細胞，用小鼠干細胞病毒（Mouse stem cell virus，MSCV）作為載體對Tcf7（其編碼的蛋白為T cell factor 1，TCF1）、GFP和CD4基因實施了基因編輯。通過體外培養(yǎng)和誘導分化，LSK細胞和DN細胞被誘導分化為下游細胞，在分化的下游細胞中檢測到基因編輯效果。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細胞、OP9細胞、OP9-DL細胞和NIH3T3細胞均為本實驗留存細胞。實驗室所使用的OP9細胞穩(wěn)定感染了含有GFP標記基因的逆轉錄病毒（MSCV）。而OP9-DL細胞也感染了逆轉錄病毒，但其中含有Notch信號配體和GFP標記基因。純合子SpCas9敲入小鼠購自The Jackson Laboratory公司。pLenti-CRISPR v2載體購自Addgene公司（#52961）。pMSCV-IRES-hNGFR載體和pMSCV-IRES-Thy1.1載體為本實驗室留存載體。流式細胞術抗體購自eBioscience公司或BioLegend公司。引物購自IDT公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA載體構建 選取4個基因Luciferase（Luc）、GFP、CD4和Tcf7，使用美國麻省理工學院在線CRISPR/Cas設計軟件（http://crispr.mit.edu：8079/？）設計相應的sgRNA（表1）。按照pLenti-CRISPR v2載體操作說明［14-15］，完成sgRNA的克隆構建工作。通過PCR方法從pLenti-CRISPR-sgRNA載體上克隆U6-sgRNA-EF1α基因片段，使用BglII和NcoI雙酶切方法將該基因片段亞克隆至逆轉錄病毒載體pMSCV-hNGFR中，從而得到pMSCVU6-sgRNA-EF1α-hNGFR載體。sgRNA載體上包含人hNGFR（human CD271，human nerve growth factor receptor）表面抗原報告基因，可以使用Anti-hNGFR抗體染色并檢測（圖1-B）。使用無內毒素質粒大提試劑盒（QIAGEN）抽提質粒備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng) HEK293T細胞和NIH3T3細胞使用DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific），培養(yǎng)基中額外加入10%胎牛血清（Atlanta Biologicals），Pen-Strep抗 生 素 和L-Glutamine（Thermo Fisher Scientific）。DMEM培養(yǎng)基相關成分混合均勻后過濾除菌，置于4℃冰箱備用。OP9細胞和OP9-DL細胞使用 MEM-α培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific），培養(yǎng)基中額外加入10%胎牛血清，Pen-Strep抗生素和L-Glutamine。MEM-α培養(yǎng)基相關成分混合均勻后過濾除菌，置于4℃冰箱備用。

表1 sgRNA靶點序列

1.2.3 病毒包裝及滴度測定 第1天晚上，在10 cm培養(yǎng)皿中種上400萬HEK293T細胞。第2天早上，使 用 Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）進行轉染。對于sgRNA病毒，每個10 cm平皿轉染5 μg pMSCV-U6-sgRNA-EF1α-hNGFR 質粒和 5 μg 逆轉錄病毒包裝質粒（本實驗室留存）。轉染24 h后換液，加入5 mL新鮮配制的DMEM培養(yǎng)基。換液后作為零點開始計時，24 h后第1次收取病毒并加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，48 h后第2次收取病毒。收集病毒后，立即使用Retro-X Concentrator（Clontech）對病毒進行濃縮處理，然后放入-80冰箱凍存。

病毒滴度測定。第1天晚上，在6孔板中種上NIH-3T3細胞，每孔20萬個細胞。第2天使用“培養(yǎng)基-病毒混合液”替換舊培養(yǎng)基：對于每個孔，使用1 948 μL新鮮培養(yǎng)基，加入50 μL濃縮后的病毒和 2 μL 的 Polybrene（終濃度為 10 μg/mL）?；旌暇鶆虿⑦B續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用Anti-hNGFR抗體染色并經流式細胞儀分析確定病毒滴度。

1.2.4 OP9細胞中基因編輯 在6孔板中種上10萬個OP9細胞，加入Cas9病毒（本實驗室留存）和GFP-sgRNA-1病毒。培養(yǎng)3 d后，取樣品使用流式細胞儀分析OP9細胞中GFP表達量。培養(yǎng)7 d后，取樣品使用流式細胞儀分析OP9細胞中GFP表達量。持續(xù)培養(yǎng)，并每隔3 d檢測GFP表達狀況變化。培養(yǎng)3周后，使用流式細胞儀將Thy1.1+hNGFR-（Cas9+sgRNA-），Thy1.1+hNGFR+（Cas9+sgRNA+），Thy1.1-hNGFR-（Cas9-sgRNA-）和 Thy1.1-hNGFR+（Cas9-sgRNA+）4個細胞群體分選出來并單獨培養(yǎng)。使用熒光顯微鏡觀察4個細胞群體的GFP表達情況。抽提Thy1.1+hNGFR+（Cas9+sgRNA+）細胞的基因組DNA，克隆GFP片段并測序。

1.2.5 DN細胞基因編輯及檢測 取純合子Cas9敲入小鼠（敲入位點為Rosa26，pCAG-hSpCas9-P2AEGFP，后簡稱Rosa26-Cas9小鼠）［16］，解剖提取其胸腺分離出胸腺中的細胞（GFP+）。使用Biotin標記的Anti-CD4抗體和Anti-CD8抗體（eBioscience）與胸腺細胞在冰上孵育20 min，之后使用BioMag?Streptavidin磁珠（QIAGEN）分離得到DN細胞。使 用 sgRNA（Luc-sgRNA-1，GFP-sgRNA-2，CD4-sgRNA-1）病毒感染DN細胞，而后37℃培養(yǎng)過夜。第2天早上除去病毒，并將DN細胞轉移到預先輻射處理過（30-Gray）的OP9-DL細胞上進行共培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入IL-7和Flt-3細胞因子（PEPROTECH），誘導DN細胞分化為下游T細胞。每隔3 d更換一半培養(yǎng)基并補充細胞因子。連續(xù)培養(yǎng)7 d后，隨后進行流式細胞儀分析（圖1-C）。

1.2.6 LSK細胞基因編輯及檢測 取純合子Cas9敲入小鼠，解剖并分離其骨髓。使用ACK細胞裂解液（ThermoFisher）裂解紅細胞。加入Mouse-Rat血清，冰上孵育20 min。加入使用Biotin標記的Anti-Mac1、Anti-Ter119和Anti-Gr1抗體與骨髓細胞在冰上孵育30 min。之后使用PBS緩沖液將未結合的抗體洗掉。將骨髓細胞與BioMag? Streptavidin磁珠混合，在4℃冷房中上下旋轉孵育30 min。使用磁鐵將磁珠清除。使用Anti-Sca1，Anti-Kit及Anti-Linage Cocktail（Lin）抗體對分離的骨髓細胞進行染色，冰上孵育20 min后使用PBS緩沖液將未結合的抗體洗掉。使用流式細胞儀將Lin-Sca1+Kit+細胞分選出來，并立即感染sgRNA病毒（TCF1-sgRNA-1，TCF1-sgRNA-2，GFP-sgRNA-2）或者空載體病毒（MSCV-Thy1.1）。補充必要的血清、Pen-Strep雙抗、L-Glutamine及細胞因子（IL3、IL6、Flt3和 SCF，PEPROTECH），而后37℃培養(yǎng)過夜。第2天早上離心后除去病毒液，在MEM-α培養(yǎng)基中加入血清、Pen-Strep雙抗、L-Glutamin及細胞因子（IL3、IL6、Flt3和SCF），而后37℃培養(yǎng)24 h。由于sgRNA病毒包含有hNGFR報告基因，而空載病毒包含Thy1.1報告基因，抗體孵育后使用流式細胞儀進行第2次分選，分別將hNGFR（sgRNA）陽性的細胞，以及Thy1.1（對照組，無sgRNA）陽性的細胞分選出來。將hNGFR+細胞和Thy1.1+細胞按照3∶1的比例混合。之后，將混合的細胞轉移到預先輻射（30 Gray）處理過的OP9-DL細胞上進行共培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入IL-7和Flt-3細胞因子。將hNGFR+細胞和預先輻射（30 Gray）處理過的OP9細胞上進行共培養(yǎng)。每隔3 d更換一半培養(yǎng)基并補充相應的細胞因子，連續(xù)培養(yǎng)兩周。之后，進行流式細胞儀分析（圖1-C）。

A：造血干細胞分化發(fā)育簡要示意圖［1-2］，相關細胞大小比例及形狀不代表真實情況。造血干細胞分化后，主要形成兩大分支：髓系細胞和淋巴系細胞（HSC：Hematopoietic stem cell，造血干細胞；MPP：Multipotent progenitor，多潛能祖細胞；CMP：Common myeloid progenitor，共同髓系前體細胞；CLP：Common lymphoid progenitor，共同淋巴系前體細胞；MEP：Megakaryocyte-erythroid progenitor，“巨核細胞/紅細胞前體細胞；GMP：Granulocyte-macrophage progenitor，粒細胞/巨噬細胞前體細胞；DC：Dendritic cell，樹突狀細胞；ETP：Early T-cell Precursor，早期T細胞前體細胞；DN：CD4-CD8- Double negative cell，DN細胞；DP：CD4+CD8+ double positive T cell，DP細胞；EILP：Early innate lymphoid progenitor，固有淋巴樣細胞前體細胞；ILC：Innate lymphoid cell，固有淋巴樣細胞；NK：Natural killer cell，自然殺傷細胞）；B：sgRNA載體結構示意圖。sgRNA由U6啟動子驅動表達，hNGFR報告基因由EF1α啟動子驅動表達；C：實驗操作方法示意圖。首先從Cas9敲入小鼠體內分離得到DN細胞或LSK細胞，通過感染逆轉錄病毒獲得陽性感染細胞。在體外培養(yǎng)并誘導分化后，使用流式細胞儀分析基因編輯結果

2 結果

2.1 MSCV-CRISPR系統(tǒng)測試

為了檢驗新構建的基于MSCV載體的CRISPR/Cas系統(tǒng)是否能夠進行基因編輯，選擇GFP為靶標基因，在持續(xù)表達GFP的OP9細胞系中進行敲除GFP的測試。將Cas9病毒和GFP-sgRNA-1病毒共感染到OP9細胞，7 d后通過流式細胞儀分析，只有Thy1.1+hNGFR+（Cas9+sgRNA+）細胞群體的GFP強度顯著下降（圖2-A）。使用流式細胞儀將Cas9+sgRNA+細胞群體分離出，克隆GFP靶點片段并測序，發(fā)現(xiàn)在靶點處有短的缺失或插入等變異（圖2-B）。這些結果表明，在OP9細胞中，由MSCV載體介導的基因編輯真實可信。

圖2 OP9細胞中基因編輯結果

2.2 DN細胞基因編輯結果

相對于從小鼠骨髓分離LSK細胞而言，從小鼠胸腺中分離DN細胞操作十分容易，且易于獲取大量的細胞。因此，我們選用Cas9敲入小鼠，首先從中分離了DN細胞（GFP+）進行實驗。分別感染了3種sgRNA（Luc-sgRNA-1，GFP-sgRNA-2，CD4-sgRNA-1）以靶向熒光素酶基因（Luc）、GFP和CD4。與Luc-sgRNA-1和CD4-sgRNA-1基因編輯結果比較發(fā)現(xiàn)，只有GFP-sgRNA-2基因編輯后出現(xiàn)GFP-細胞群體。與Luc-sgRNA-1和GFP-sgRNA-2基因編輯結果比較發(fā)現(xiàn)，只有CD4-sgRNA-1基因編輯后下游細胞中CD4+細胞比例大幅下降，同時CD8+細胞比例卻大幅增加（圖3）。這一結果表明，使用Cas9敲入小鼠，以逆轉錄病毒作為載體，可以在小鼠原代DN細胞中實現(xiàn)基因編輯。

圖3 DN細胞體外基因編輯結果

2.3 LSK細胞基因編輯結果

在上述實驗基礎上，針對LSK細胞進行了基因編輯測試。我們使用Cas9敲入小鼠進行相關實驗，并通過流式細胞儀分選出LSK細胞。隨后，分別感染 了 3種 sgRNA（TCF1-sgRNA-1，TCF1-sgRNA-2，GFP-sgRNA-2）以靶向Tcf7和GFP。由于敲除TCF1后，LSK細胞不能正常分化為下游T細胞［17］。因此，我們加入了感染空病毒（MSCV-Thy1.1）的LSK細胞作為內參。體外培養(yǎng)時，使用3∶1的比例進行共培養(yǎng)。在GFP-sgRNA-2基因編輯組中，經過2周體外培養(yǎng)后，hNGFR陽性細胞與Thy1.1細胞比例變?yōu)?.5∶1（29.5%∶8.54%）。這一比例與初始培養(yǎng)時3∶1的比例接近。而在TCF1-sgRNA-1基因編輯組中，hNGFR陽性細胞與Thy1.1細胞比例變?yōu)?∶7.7（2.31%∶17.7%）。在TCF1-sgRNA-2基因編輯組中，hNGFR陽性細胞與Thy1.1細胞比例變?yōu)?∶3.6（3.83%∶13.7%）（圖 4-A）。將感染了Tcf7基因sgRNA病毒的LSK細胞與OP9細胞共培養(yǎng)時，LSK細胞會發(fā)育為髓系免疫細胞。由于TCF1對于髓系免疫細胞發(fā)育非必需，因此當TCF1被敲除后，骨髓系免疫細胞發(fā)育不受影響［17］。在實驗中，在GFP-sgRNA-2，TCF1-sgRNA-1，TCF1-sgRNA-2 三個基因編輯組中，都有高比例的hNGFR陽性細胞（41.8%∶49.9%∶40.0%）（圖4-B）。這些hNGFR陽性細胞都有高比例的Mac1陽性細胞（結果未展示）。這表明，使用MSCV病毒為載體可以在Cas9敲入小鼠的LSK細胞中有效實施基因編輯。

圖4 LSK細胞體外基因編輯結果

3 討論

本研究從Cas9敲入小鼠中分離相關造血干細胞和免疫前體細胞，通過逆轉錄病毒（MSCV）作為載體實施了基因編輯。在能夠感染MSCV病毒的情況下，這一方法可能適用于大鼠等親緣關系較近的哺乳動物。雖然使用MSCV病毒載體可以高效感染LSK和DN細胞，但病毒穩(wěn)定整合到細胞基因組中，并持續(xù)不斷地表達可能會對LSK細胞和DN胞分化發(fā)育造成不利影響，并引發(fā)更多的脫靶效應。未來可以考慮構建可以被誘導表達的CRISPR/Cas統(tǒng)，或者采用非整合病毒載體來介導實施基因編輯。此外，從Cas9敲入小鼠中分離相應細胞實施基因編輯，在一定程度上限制了這一方法的應用。未來可以構建同時含有Cas9和sgRNA表達元件的病毒載體，將有助于解決這一問題。

在LSK細胞中實施基因編輯并在體外誘導其分化，這一技術平臺的建立有助于研究造血干細胞早期分化發(fā)育分子機制。由于造血干細胞在免疫系統(tǒng)中具有最高的分化潛能，在其中實施基因編輯，其下游細胞都會繼承相同的遺傳學特征。這使得我們在對特定基因實施敲除后，可以在更廣的范圍內研究該基因對免疫系統(tǒng)其他細胞分化發(fā)育的影響。本研究中只介紹了在體外環(huán)境中針對LSK和DN細胞實施基因編輯的研究結果，缺乏小鼠個體水平實驗研究結果。如果能夠將這一技術方法延伸，將相關基因編輯的LSK細胞移植到受體小鼠體內，并利用體內環(huán)境誘導編輯后的LSK細胞分化發(fā)育重建免疫系統(tǒng)，這將極大提升這一方法的價值和意義。此外，近年來單細胞組學技術快速發(fā)展，高通量單細胞轉錄組分析技術方法也成功建立［18-19］。綜合運用這些技術方法將推動免疫細胞發(fā)育研究快速向前發(fā)展。

4 結論

從Cas9敲入小鼠中分離原代LSK細胞或DN細胞，使用逆轉錄病毒作為載體將sgRNA表達元件導入到相應細胞中引發(fā)基因編輯。在DN細胞中成功敲除GFP和CD4表面抗原的表達；在LSK細胞中成功敲除T細胞分化關鍵因子TCF1的表達。

［1］Blank U, Karlsson S. TGF-β signaling in the control of hematopoietic stem cells［J］. Blood, 2015, 125（23）：3542-3550.

［2］王振, 丁曉丹, 張巖, 等. 胚胎干細胞向造血細胞分化的研究進展［J］. 中國細胞生物學學報, 2013, 35（7）：907-915.

［3］Mandal PK, Ferreira LM, Collins R, et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9［J］. Cell Stem Cell, 2014, 15（5）：643-652.

［4］Gundry MC, Brunetti L, Lin A, et al. Highly efficient genome editing of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9［J］. Cell Rep, 2016, 17（5）：1453-1461.

［5］Dever DP, et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells［J］. Nature, 2016, 7629 ：384-389.

［6］Hoban MD, Lumaquin D, Kuo CY, et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+cells［J］. Mol Ther, 2016, 24（9）：1561-1569.

［7］De Ravin SS, et al. CRISPR-Cas9 gene repair of hematopoietic stem cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease［J］. Sci Transl Med, 2017, 9（372）：pii：ecah3480.

［8］Xu L, Yang H, Gao Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated CCR5 ablation in human hematopoietic stem/progenitor cells confers HIV-1 resistancein vivo［J］. Mol Ther, 2017, 25（8）：1782-1789.

［9］劉改改, 李爽, 韋余達, 等. 利用 CRISPR/Cas9 技術對人多能干細胞進行高效基因組編輯［J］. 遺傳, 2015（11）：1167-1173.

［10］璩良, 李華善, 等. CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的分子機制及其在人類疾病基因治療中的應用［J］. 遺傳, 2015, 37（10）：974-982.

［11］Heckl D, et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing［J］. Nat Biotechnol, 2014, 32（9）：941-946.

［12］Parnas O, Jovanovic M, Eisenhaure TM, et al. A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks［J］. Cell, 2015, 162（3）：675-686.

［13］Chu VT, Graf R, Wirtz T, et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113（44）：12514-12519.

［14］Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genomewide libraries for CRISPR screening［J］. Nat Methods, 2014, 11（8）：783-784.

［15］Shalem O, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells［J］. Science, 2014, 343（6166）：84-87.

［16］Platt RJ, et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling［J］. Cell, 2014, 159（2）：440-455.

［17］Weber BN, Chi AW, Chavez A, et al. A critical role for TCF-1 in T-lineage specification and differentiation［J］. Nature, 2011, 476（7358）：63-68.

［18］Papalexi E, Satija R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity［J］. Nat Rev Immunol, 2017.

［19］Stubbington MJT, Rozenblatt-Rosen O, Regev A, et al. Single cell transcriptomics to explore the immune system in health and disease［J］. Science, 2017, 358（6359）：58-63.