非人靈長類動物基因編輯技術(shù)的應(yīng)用及挑戰(zhàn)

畢延震 肖紅衛(wèi) 張立蘋 任紅艷 華再東 華文君 王正 牛敏杰林鄭云 任習(xí)東 孫理華 鄭新民

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2. 湖北天勤生物科技有限公司，武漢 430064）

隨著人類醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，更廣泛深入地了解疾病病理并確定治療策略已非常迫切。建立動物模型是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究人類疾病的重要方法，選定動物與人類之間的物種差異直接決定了該動物模型的有效性。迄今為止，人類在小鼠等嚙齒類動物模型的構(gòu)建上做了大量研究［1-2］，但不管在生理狀況還是遺傳調(diào)控方面，嚙齒類動物與人類都存在較大差異，這也極大程度限制了小鼠等動物在人類疾病動物模型中的應(yīng)用。與其它動物相比，非人靈長類動物（Nonhuman primate，NHP）在進化發(fā)育、生理生化及病理方面和人類最為接近。2011年，中國科學(xué)家完成了食蟹猴和恒河猴基因組的比較分析［3］，獼猴與人類基因組同源性高達93%［4］。由此可見，非人靈長類動物是研究人類疾病的理想動物模型。

模仿人類疾病的非人靈長類動物模型很難以自發(fā)突變的方式獲得。因此，通過基因編輯的方法獲得攜帶人類致病基因的動物模型對研究人類疾病非常關(guān)鍵。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法不僅效率低，且需要大量胚胎干細胞，費時費力。由于非人靈長類動物較長的性成熟周期和較低的生育率，利用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法對其進行基因修飾難度極大，相關(guān)模型的構(gòu)建進展非常緩慢。CRISPR/Cas9是繼ZFNs和TALENs技術(shù)之后迅速發(fā)展起來的第三代基因組編輯技術(shù)，其成本低、制作簡單、效率更高，迅速成為了各研究領(lǐng)域有效的基因編輯工具。隨著應(yīng)用的深入，CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)、嵌合突變等突出問題也受到研究者的重視，并做了一系列改進。本文就基因編輯技術(shù)在非人靈長類動物中的應(yīng)用研究、存在的突出問題及應(yīng)對策略作簡要概述，為進一步研究人類疾病非人靈長類動物模型建立提供借鑒與參考。

1 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法和TALENs基因編輯技術(shù)在非人靈長類動物中的應(yīng)用

1.1 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法建立非人靈長類動物模型

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因靈長類動物的方法主要利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法，其原理是將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，通過感染宿主細胞，將外源目的基因整合到宿主基因組中。自2001年美國科學(xué)家利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法獲得世界上第一只攜帶綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因非人靈長類動物ANDi以來［5］，研究者們通過慢病毒法建立了多個模仿人類神經(jīng)疾病的非人靈長類動物模型。所獲得的轉(zhuǎn)基因猴模型，都表現(xiàn)出所模擬的人類疾病相關(guān)主要臨床癥狀［6-8］。在第一代轉(zhuǎn)基因非人靈長類動物的基礎(chǔ)上，還孕育出第二代攜帶相同基因修飾并具有同樣臨床癥狀的動物模型，進一步證明這種遺傳改造可以實現(xiàn)生殖系傳遞［8-9］。

雖然研究者通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法在非人靈長類動物模型構(gòu)建中取得了一定進展，但是這些基因修飾位點都是隨機的，具有不確定性，無法獲得精確基因修飾的非人靈長類動物模型。轉(zhuǎn)基因方法較低的效率也制約了其應(yīng)用，雖然Niu等［10］利用以猴免疫缺陷病毒（SIV）為基礎(chǔ)的慢病毒載體成功構(gòu)建了EGFP轉(zhuǎn)基因恒河猴，轉(zhuǎn)化效率比之前的報道有較大提高，但在生長周期較長的非人靈長類動物中應(yīng)用進展仍然非常緩慢，研究者迫切需要更精確高效的基因編輯技術(shù)來進行相關(guān)研究。

1.2 ZFNs和TALENs基因編輯技術(shù)建立非人靈長類動物模型

鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）在結(jié)構(gòu)上包括鋅指蛋白（ZFP）結(jié)構(gòu)域和Fok I切割結(jié)構(gòu)域［11］，類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）是由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）代替鋅指作為DNA結(jié)合域與FokI切割域組成的基因編輯工具［12］。ZFNs和TALENs分別通過鋅指蛋白和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物識別DNA序列，并在特定位點對DNA進行切割，形成雙鏈斷裂，隨后誘導(dǎo)細胞內(nèi)的修復(fù)機制，在非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（Homologous Recombination，HR）修復(fù)機制下實現(xiàn)基因敲除或敲入。

構(gòu)建和設(shè)計ZFNs花費時間較長，成本很高，而且脫靶效應(yīng)非常嚴重。至今尚沒有ZFNs在非人靈長類動物中研究應(yīng)用的報道。相對于ZFNs，TALENs技術(shù)設(shè)計相對簡單，成本較低，而且DNA序列設(shè)計特異性高，脫靶效應(yīng)較低。2014年，中國科學(xué)家Liu等［13］首次利用TALENs技術(shù)，獲得了可導(dǎo)致雷特綜合征（Rett syndrome，RTT）的MECP2突變基因的雌性食蟹猴。RTT食蟹猴與RTT病人在基因型和表型上都有很多相似性，對人類研究RTT的發(fā)病機制和治療方法有非常重要的意義［14］。常染色體隱性遺傳性小頭畸形（Microcephaly，MCPH）是一種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙疾病，Ke等［15］利用TALENs技術(shù)，構(gòu)建了攜帶雙等位基因MCPH1突變的食蟹猴，并表現(xiàn)出小頭畸形病的臨床特征。為更好地研究MCPH1致病機制提供了有效的動物模型。

TALENs技術(shù)已經(jīng)在實際研究中有了較多報道。但是，TALENs基因編輯技術(shù)針對不同靶位點需要設(shè)計不同的識別蛋白，涉及巨大的蛋白改造工作，耗時耗力且成本高，對多基因位點打靶更是極不便利。這些局限性都嚴重制約了它的廣泛應(yīng)用。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在非人靈長類動物中的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為大多數(shù)細菌和古菌的獲得性免疫系統(tǒng)，由規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和相關(guān)的Cas蛋白組成，通過RNA介導(dǎo)，利用短的非編碼RNA（crRNA），指導(dǎo)Cas內(nèi)切酶蛋白到達目的位點，對靶基因進行特異性切割［16］。隨著對系統(tǒng)功能和機制的深入了解，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為兩個大類（class1和class2），進而又可分為6個類型，共16個亞型［17-18］。class1包括I、III和IV三個類型，這類CRISPR/Cas系統(tǒng)利用多個蛋白組成的復(fù)合效應(yīng)體對靶基因進行干擾，干擾機制比較復(fù)雜。class2系統(tǒng)則是利用具有多結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白單體干擾靶基因，包括II、V和VI三個類型。其中，Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)典型的效應(yīng)蛋白為Cas9，其切割位點位于靶序列3'端PAM 序列上游3 bp，形成平末端的DNA雙鏈斷裂。V型CRISPR/Cas系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白為Cpf1，它不需要反式激活crRNA便可實現(xiàn)靶位點切割，切割位點可形成5'突出的粘性末端［19-20］，Cpf1蛋白在基因編輯研究中也極具應(yīng)用潛力。VI型CRISPR/Cas系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白為C2c2，它具有RNA指導(dǎo)的單鏈RNA酶切活性，為 RNA 編輯提供了新工具［18，21］。

Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)較早，機制簡單且易于操作，是目前機制研究最清楚和應(yīng)用最廣泛的一套體系［22-24］。CRISPR/Cas9基因編輯方法為人類進一步研究非人靈長類動物模型建立，找到治療人類遺傳性疾病更好更有效的治療方法提供了技術(shù)支持。

2.1 非人靈長類動物模型多基因敲除的實現(xiàn)

已報道的基因編輯技術(shù)在非人靈長類動物中的研究，都只實現(xiàn)了單基因敲除。2014年2月，來自云南省靈長類生物醫(yī)學(xué)重點實驗室、南京大學(xué)模式動物中心和南京醫(yī)科大學(xué)的研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)，首次獲得了攜帶定向突變基因的孿生食蟹猴，并同時實現(xiàn)了兩個基因（Ppar-γ和Rag1）的敲除。在隨后對新生猴DNA樣本分析檢測中未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)［25］。同年12月，該聯(lián)合實驗室在對所獲基因工程猴的后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，靶向基因突變性狀在食蟹猴的各個組織細胞中均有表達，包括生殖系細胞，基因修飾極有可能通過生殖細胞遺傳到下一代［26］。這項研究的突破，為以后構(gòu)建模仿多基因突變疾病的非人靈長類動物模型奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

2.2 非人靈長類動物疾病模型的建立

CRISPR/Cas9技術(shù)自2013年問世以來，研究者已經(jīng)建立了多個模仿人類疾病的非人靈長類動物中模型，研究速度大幅提升。杜氏肌萎縮癥疾?。―uchenne muscular dystrophy，DMD）是一種X染色體連鎖隱性遺傳疾病，因肌蛋白dystrophin的基因突變造成其功能喪失而引起。發(fā)病率為活產(chǎn)男嬰的1 /30 000。2015年，Chen等［27］使用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變獼猴的肌營養(yǎng)不良蛋白基因，分析因難產(chǎn)而死亡猴的肌肉組織發(fā)現(xiàn)，dystrophin蛋白表達明顯下降或消失，并表現(xiàn)出類似于DMD病人早期出現(xiàn)的肌肉細胞退化的病理特征。對所獲基因編輯恒河猴模型DNA樣本分析檢測中未發(fā)現(xiàn)明顯的脫靶效應(yīng)。同年，Kang等［28］利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了DAX1基因缺失的食蟹猴模型，DAX1突變可引發(fā)X連鎖先天性腎上腺發(fā)育不全（Adrenal hypoplasia congenita，AHC）和促性腺激素分泌不足的性腺功能低下癥（Hypogonadolropic hypogonadism，HH），這只DAX1基因突變猴表現(xiàn)出腎上腺發(fā)育缺陷和異常的睪丸結(jié)構(gòu)的臨床表征與AHC-HH患者非常相似。Wan等［29］優(yōu)化了CRISPR/Cas9技術(shù)，不經(jīng)過種系交配而一步直接獲得p53（腫瘤抑制基因）突變的食蟹猴模型。Midic等［30］獲得了導(dǎo)致β地中海貧血癥的珠蛋白HBB突變獼猴模型，經(jīng)分析并未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)（表1）。

表1 利用基因編輯技術(shù)建立的非人靈長類動物模型

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)存在問題及應(yīng)對策略

CRISPR/Cas9技術(shù)憑借其高效準確且設(shè)計操作簡便等諸多優(yōu)點，已成為近幾年最受關(guān)注的基因編輯技術(shù)。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)至今才興起短短幾年時間，卻已經(jīng)取得了很多劃時代的突破性進展。隨著對CRISPR/Cas9系統(tǒng)了解不斷深入，一些突出問題引起了研究者的重視。

3.1 CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)可能引入非預(yù)期突變

2014年初，Nature Methods雜志將TALEN和CRIS-PR/Cas9技術(shù)評為2014年值得關(guān)注技術(shù)，同時也明確指出了CRISPR/Cas9的脫靶現(xiàn)象［31］。多個研究組的研究也證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)有著較高的脫靶活性［32-34］。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非人靈長類動物的應(yīng)用研究中尚未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)，但是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人類三核胚胎進行人類珠蛋白HBB基因編輯的研究中卻發(fā)現(xiàn)有脫靶效應(yīng)的存在［35］。這不得不讓我們反思CRISPR/Cas9系統(tǒng)未在非人靈長類動物中發(fā)生脫靶效應(yīng)的原因，可能我們對猴類基因組的研究還不夠深入導(dǎo)致。但是建立非人靈長類動物模型研究人類疾病，脫靶效應(yīng)是亟待解決的問題。為了提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效應(yīng)，研究者做了大量研究工作，可以指導(dǎo)我們建立更加精準打靶的非人靈長類動物模型（圖1）。

3.1.1 Cas9蛋白優(yōu)化 Ran等［36］通過分別突變Cas9蛋白的兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵催化殘基D10A或H840A發(fā)現(xiàn)，Cas9切口酶突變體D10A Cas9，配合一對gRNA，在目標基因位置配對切口，雙切口使脫靶效應(yīng)降低了50-1 500倍。盡管引入一對Cas9雙切口酶比野生型Cas9蛋白的靶點切割特效性更高，但是仍然存在著脫靶現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，將D10A和H840A兩個催化殘基同時突變，獲得失去切割活性但仍保留DNA結(jié)合活性的dCas9，將dCas9與非特異性的核算內(nèi)切酶FokI形成融合蛋白（dCas9-FokI）。只有當(dāng)兩個融合蛋白單體彼此靠近形成二聚體時才能對靶基因進行切割，大大降低了脫靶效應(yīng)［37-38］。張鋒團隊［39］對Cas9蛋白結(jié)構(gòu)分析，Cas9酶約有1 400個氨基酸，用丙氨酸替代其中3個氨基酸位點，獲得的增強型Cas9（eSpCas9）有精確的靶向功能，脫靶效應(yīng)減少到無法檢測的水平。Joung團隊［40］替換Cas9蛋白4條鏈，獲得高保真型Cas9（SpCas9-HF1）。該突變核酸酶與非特異性序列結(jié)合力更弱，增強靶向序列與Cas9 蛋白結(jié)合的競爭力，可以將超過85%的靶序列切割，但是卻檢測不到非特異性序列切割。

3.1.2 Cas9蛋白表達調(diào)控優(yōu)化 Cas9蛋白在體內(nèi)長時間的表達和持續(xù)活性會增大脫靶效應(yīng)的風(fēng)險。研究者利用Cas9蛋白的“調(diào)控開關(guān)”，有目的性地開啟和關(guān)閉Cas9表達，降低脫靶效應(yīng)。Tan等［41］將Cas9和雌激素受體結(jié)合域ERT2融合（Cas9-ERT2），通過4-羥基他莫昔芬（4-HT）化合物誘導(dǎo)，可逆調(diào)控Cas9蛋白表達。同樣，將Cas9蛋白分成兩個失活片段paCas9，每個失活片段融合Magnet蛋白。藍光的照射或切斷，能將Magnet蛋白結(jié)合或分開，從而可逆地調(diào)控 Cas9 蛋白活性［42］。Rauch 等［43］發(fā)現(xiàn)了Cas9的抑制蛋白AcrIIA2和AcrIIA4。AcrIIA4能夠阻斷Cas9酶活性，減少了Cas9在細胞中長時間的持續(xù)活性帶來的脫靶效應(yīng)，使脫靶發(fā)生率降低了4倍，而靶位點的基因編輯未受到影響。

3.1.3 gRNA核苷酸序列設(shè)計優(yōu)化 現(xiàn)在有大量的數(shù)據(jù)庫可以對目的序列BLAST進行脫靶預(yù)測，并通過數(shù)據(jù)庫分析提高gRNA的靶向特異性［44-45］。Hsu等［46］通過建立計算機模型，計算出最優(yōu)化的gRNA核苷酸鏈長度，可以降低脫靶效應(yīng)。Seung等［47］通過設(shè)計一系列長度不同的gRNA，發(fā)現(xiàn)gRNA不僅能影響Cas9蛋白活性，還能影響脫靶效應(yīng)的發(fā)生。Fu等［48］也進一步證實了縮短gRNA核苷酸序列，不但沒有影響gRNA的靶向功能，還使脫靶率降低了5 000倍?？s短一對gRNA的核苷酸序列，配合上述dCas9-FokI融合蛋白使用，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性大幅提高［49］。

圖1 提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在非人靈長類動物模型中打靶效應(yīng)的優(yōu)化策略

3.2 CRISPR/Cas9嵌合突變造成遺傳異質(zhì)性（Heterozygous）

CRISPR/Cas9技術(shù)在非人靈長類動物中引起的嵌合突變是另一個值得關(guān)注的問題。在已報道獲取的CRISPR/Cas9基因修飾新生猴，基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有多種基因型，表明所獲基因修飾猴為嵌合體［25］，DMD猴模型的嵌合突變率達到87%［27］。由于非人靈長類動物生長周期長，通過多代交配篩選到純靶向基因修飾的動物模型需要花費大量時間和經(jīng)費。嵌合突變也會嚴重影響靶基因功能研究和相關(guān)疾病病理分析，因此減少嵌合體的產(chǎn)生尤為必要。

引起嵌合突變的原因主要有兩種：其一，Cas9修飾靶位點后，由于分裂細胞之間DNA修復(fù)活性存在較大差異，導(dǎo)致不同細胞、組織之間發(fā)生不同程度的靶基因突變；其二，雙鏈DNA斷裂在非同源末端連接的修復(fù)過程中，會發(fā)生堿基隨機插入和缺失（Insertion/deletion，indel），導(dǎo)致靶位點indel各不相同，形成多基因型嵌合突變體。目前研究表明Cas9蛋白的持續(xù)表達可能會增加嵌合突變，使靶基因編輯發(fā)生在細胞分裂前的單細胞階段，是比較有效降低嵌合突變的方法之一。Tu等［50］通過在Cas9蛋白N末端連接泛素蛋白酶體，能促進Cas9蛋白在食蟹猴胚胎中降解，結(jié)合胚胎分裂方法，縮短Cas9半衰期能夠減少嵌合突變并提高打靶效率。在小鼠中，用電轉(zhuǎn)化或顯微注射法將Cas9 mRNA和sgRNA注入受精卵中，產(chǎn)生了大量的嵌合突變體。用Cas9蛋白和sgRNA電轉(zhuǎn)化法替代上述方法，在受精卵單細胞分裂前完成基因編輯，嵌合突變率大幅降低［51］。同時，在嵌合突變的檢測方法上，傳統(tǒng)的Sanger基因組測序、T7EN1等技術(shù)存在儀器和人為誤差，導(dǎo)致突變位點檢測存在遺漏。建立更嚴格有效的全基因組深度測序法，實現(xiàn)對靶基因嵌合突變的全面評估分析，對建立更有效精準的非人靈長類動物模型也有指導(dǎo)性作用［52-54］。

3.3 CRISPR/Cas9基因敲入效率較低

目前利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對非人靈長類動物進行基因編輯，DNA發(fā)生同源重組修復(fù)（HR）的幾率非常低，僅在利用Cas9技術(shù)對食蟹猴p53基因編輯過程中，成功實現(xiàn)了小片段DNA序列敲入和基因定點突變［29］。然而，大片段基因序列靶向敲入在非人靈長類動物中尚無成功報道。研究者試圖通過阻斷非同源末端連接的修復(fù)途徑（NHEJ），以期提高HR幾率?？拱┧幬颯cr7可與NHEJ信號通路中的關(guān)鍵酶Ligase IV結(jié)合，阻止DNA的NHEJ途徑。Maruyama等［55］將Scr7添加到基因編輯的小鼠受精卵中，顯著提高了小鼠模型的同源重組修復(fù)。Aida等［56］通過優(yōu)化CRISPR/Cas系統(tǒng)，使其包含Cas9蛋白、CRISPR RNA（crRNA）以及反義激活crRNA三個部分，實現(xiàn)了小鼠基因組中較長基因盒的靶向敲入。這些研究思路也可以指導(dǎo)我們應(yīng)用于非人靈長類動物模型中。

4 結(jié)語

由于人體的復(fù)雜性與倫理方面的限制，以人體本身作為實驗對象來研究疾病機制及醫(yī)學(xué)治療策略是極其緩慢且困難的。例如，2016年，我國科學(xué)家利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人類三核胚胎進行HBB基因修飾［35］，雖然三核胚胎不能發(fā)育成正常人類胚胎，但是在基因編輯技術(shù)還不是非常完善的背景下，這個實驗在國際倫理上引起了巨大爭議。同年，中國科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人類淋巴細胞的PD-1基因，將修飾后的細胞重新注入患者體內(nèi)進行人類肺癌臨床治療實驗［57］，這次基因治療只針對放化療和其他治療手段均無效的志愿者，因此治療對象比較局限。最近，Nature雜志發(fā)布了美國科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)對正常的人類胚胎進行編輯，成功修復(fù)了遺傳性肥厚型心肌病的致病MYBPC3突變基因，引起巨大轟動［58］，但是對人體實驗的倫理約束極大限制了實驗結(jié)果的進一步驗證。目前，國際上有望出臺基因編輯技術(shù)在人體中的應(yīng)用細則。但是，禁止對人類生殖系進行基因編輯是人類普遍的共識。

建立模仿人類疾病的有效動物模型，可以避免直接進行人體實驗的風(fēng)險。作為與人類生理生化上相似度最高的動物，非人靈長類動物建立人類疾病模型能夠更真實有效地模擬人類疾病并研究疾病的治療策略，是替代人體模型的極佳選擇。但是，由于非人靈長類動物較長的生長周期和高昂的飼養(yǎng)費用，特別是缺乏高效的基因修飾技術(shù)，造成非人靈長類動物疾病模型的研究困難重重。近年來，得益于基因編輯技術(shù)的重大突破，才使得該領(lǐng)域的研究逐漸有了起色（表1）。不過目前已報道的非人靈長類動物疾病模型，大部分都局限于模仿人類神經(jīng)性遺傳疾病的范疇。借鑒其它動物疾病模型的相關(guān)研究思路和技術(shù)路線，可建立疾病覆蓋面更廣的非人靈長類動物模型，如治愈白內(nèi)障模型［59］，或是通過多個抑癌基因突變構(gòu)建癌癥模型［60-61］等。在此基礎(chǔ)上，進一步分析非人靈長類動物模型的疾病演進機制，對相關(guān)模型開展治療方法的探索與評估［62-63］，將為人類征服重大疾病、提高生存質(zhì)量和預(yù)期壽命作出巨大貢獻（圖2）。

我國是世界上擁有最豐富非人靈長類動物資源的國家之一，目前在運用基因編輯技術(shù)構(gòu)建非人靈長類動物模型的研究領(lǐng)域中處于世界領(lǐng)先水平。不過，隨著對基因編輯技術(shù)應(yīng)用的不斷深化與擴展，脫靶效應(yīng)、嵌合突變等突出問題應(yīng)該引起足夠重視。相信隨著基因編輯技術(shù)的不斷完善，研究人員將有更大的創(chuàng)新空間，非人靈長類動物疾病模型必然會在人類醫(yī)學(xué)健康研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

圖2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建非人靈長類動物疾病模型的研究策略

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