鲇源異嗜糖氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性

胡秀彩， 陸夢瑩， 孫敬鋒， 呂愛軍， 陳成勛， 王曉梅

(天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室/天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384)

氣單胞菌屬(Aeromonas)細菌廣泛分布于淡水、海水等水生環(huán)境，正常條件下在養(yǎng)殖水體及水產(chǎn)動物體內(nèi)均存在，多為條件致病菌[1-2]。氣單胞菌組成與分類較為復(fù)雜，目前在水產(chǎn)動物中發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、維氏氣單胞菌(A.veronii)和異嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)等多個種[3]。近年來，國內(nèi)外有關(guān)異嗜糖氣單胞菌的研究主要集中在人類和哺乳動物方面[4-5]。Lee等最早從美國腹瀉患者體內(nèi)分離獲得異嗜糖氣單胞菌，即ATCC35942模式菌株[4]。Saavedra等分離到豬源氣單胞菌菌株，經(jīng)gyrB和16S rRNA基因鑒定為異嗜糖氣單胞菌[5]。最近，李欣悅等對氣單胞菌分類研究發(fā)現(xiàn)gyrA基因在異嗜糖氣單胞菌鑒定中更加準確[6]。

關(guān)于魚源異嗜糖氣單胞菌的分離鑒定，目前鮮有報道[3，7-8]。劉雙鳳等從史氏鱘(Acipenserschrencki)體內(nèi)分離到1株致病菌，經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定為異嗜糖氣單胞菌[7]。Martinezmurcia等對歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)CECT4199菌株進行理化特性、16S rRNA分子鑒定研究，確定為異嗜糖氣單胞菌[3]。楊求華等從發(fā)病鰻鱺(A.japonica)臟器中分離到異嗜糖氣單胞菌，動物感染試驗證實該菌對鰻鱺具有致病性[8]。本研究首次從自然發(fā)病鲇魚(Silurussp.)腹水等組織中分離出1株細菌，病魚主要表現(xiàn)為體表出血、肛門紅腫突出、腹部膨大等臨床癥狀，采用理化特性結(jié)合16S rDNA用基因序列分子鑒定及其藥物敏感性，這不僅為異嗜糖氣單胞菌的致病機理奠定基礎(chǔ)，而且為該病的預(yù)防治療提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病鲇(Silurussp.)來自天津某養(yǎng)殖場；2×TaqPCR MixPCR預(yù)混體系、DNA Marker DL2000、LB瓊脂以及藥敏紙片，均購自上海捷瑞生物工程；細菌總基因組提取試劑盒(DNA)、膠回收試劑盒(離心柱型)，均購自上海生工生物工程有限公司；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ-11e，購自環(huán)凱微生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離純化 參照胡秀彩等的方法[9]進行，無菌操作取患病鲇腹水等組織，接種于LB平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。挑取優(yōu)勢單菌落接種純化，經(jīng)過2～3次傳代純化后得到純菌種，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩＞喊凑? ∶1的比例，取0.5 mL菌液于1.5 mL離心管，加入0.5 mL 40%甘油，封口膜封口，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 細菌形態(tài)特征及理化特性檢查 將分離菌株接種于新配制的LB固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)18 h，肉眼觀察菌落形態(tài)記錄，并進行革蘭氏染色鏡檢。無菌操作接種供試菌株于細菌生化編碼鑒定管中，按照常規(guī)方法進行硝酸鹽還原、糖(醇、苷)類代謝等19種理化特性測定，參照文獻[2]進行。

1.2.3 動物感染試驗 健康鲇體質(zhì)量約40.0 g，購自天津某養(yǎng)殖場；斑馬魚體質(zhì)量約0.5 g，購自天津某水產(chǎn)市場。參照黎烔等的方法[10]，將分離到的菌株用0.65%的生理鹽水制成2.0×108CFU/mL的菌懸液。選取健康鲇和斑馬魚作為試驗對象，采取腹腔注射的方法進行試驗。每組10尾魚，試驗組鲇魚每尾注射0.15 mL菌懸液，斑馬魚每尾注射10 μL菌懸液；對照組鲇魚、斑馬魚等量注射0.65%無菌生理鹽水。試驗魚感染后連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計鲇和斑馬魚發(fā)病死亡情況。

1.2.4 細菌基因組DNA提取 將分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后期至菌液渾濁。取2 mL菌液于2 mL離心管中，12 000 r/min離心 2 min，棄去上清液，向離心管中加入500 μL無菌雙蒸水，渦旋30 s，置于95 ℃水浴5 min，12 000 r/min離心2 min，以上清液作為模板。

1.2.5 細菌16S rDNA基因序列的擴增及測序 細菌16S rDNA采用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物來自上海生工生物工程有限公司。PCR擴增反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板 1 μL，無菌雙蒸水 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，56 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因，并將PCR擴增產(chǎn)物送金唯智生物科技有限公司進行基因測序。將16S rDNA序列通過NCBI的Blast檢索序列同源性分析，采用MEGA 5.05軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 藥敏試驗 藥敏試驗采用K-B紙片法對分離菌株進行30種常用抗生素藥物的敏感性檢測，將分離菌株均勻涂布于LB平板上，依次貼上藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)36 h后，測量抑菌圈直徑3次，取平均值，以抑菌圈直徑大小作為判定細菌對藥物敏感性的標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株SJ-2菌體及理化特性

從病鲇腹水中分離純化獲得1株細菌，編號為SJ-2，該菌株在LB固體培養(yǎng)基上形成圓形、透明、表面濕潤、邊緣整齊的小菌落，為革蘭氏染色陰性短桿狀，兩端鈍圓(圖1)。細菌生理生化試驗結(jié)果表明，SJ-2菌株為發(fā)酵型細菌，葡萄糖產(chǎn)氣、氧化酶、硝酸鹽還原、吲哚產(chǎn)生、V-P、枸櫞酸鹽、尿素、動力、葡萄糖酸鹽、賴氨酸脫羧酶為陽性，鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶、硫化氫、M.R、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木糖為陰性等，該菌株的菌體形態(tài)和生理生化特性基本符合氣單胞菌屬(Aeromonas)特征。

2.2 分離菌的16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

以分離菌SJ-2基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增16S rDNA序列，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測大小約為1 500 bp的目的條帶(圖2)，16S rDNA測序獲得基因片段長為 1 401 bp；通過Blast檢索系統(tǒng)進行基因序列同源性比對，表明菌株SJ-2的16S rDNA基因序列與Aeromonasallosaccharophila模式菌株ATCC51208(=CECT4199，=DSM11576)的16S rDNA序列相似性達99.64%；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示分離菌SJ-2與Aeromonasallosaccharophila親緣關(guān)系最近、自然聚為一支(圖3)，進一步確定SJ-2為異嗜糖氣單胞菌(A.allosaccharophila)。

2.3 動物感染試驗結(jié)果

人工腹腔注射斑馬魚(D.rerio)感染12 h后出現(xiàn)肛門紅腫、腹部膨大等癥狀，48 h死亡率達100%；人工回感染鲇(Silurussp.)出現(xiàn)皮膚變白、局部出血、腹部膨大，解剖有大量腹水等癥狀，72 h累積死亡率達20%，并且從發(fā)病魚肝臟、腹水等組織中再次分離到與SJ-2菌株特征一致的細菌。生理鹽水對照組魚無發(fā)病死亡現(xiàn)象。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

表1 菌株SJ-2的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

氣單胞菌是一類重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病原菌，能導(dǎo)致多種魚類感染患病，一旦暴發(fā)往往造成巨大的經(jīng)濟損失[11]。目前，已有報道顯示氣單胞菌可引起魚類、爬行類、兩棲類、無脊椎動物和哺乳動物患病，魚類感染后可引起出血性敗血癥和流行性潰瘍綜合征(EUS)等癥狀[12-13]。氣單胞菌組成與分類較為復(fù)雜，國外學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)2株異嗜糖氣單胞菌菌株，1株來自鰻鱺(A.anguilla)，另1株來自腹瀉患者[3，5]，而且該菌與異嗜糖氣單胞菌DNA雜交分類結(jié)果一致[14]。Saavedra等從一個患腸胃炎病例分離到1株菌株，經(jīng)gyrB和16S rRNA基因序列分析鑒定為異嗜糖氣單胞菌[5]。Huys等研究表明異嗜糖氣單胞菌表型和基因型特征與維氏氣單胞菌密切相關(guān)[15]。Nhung等通過細菌基因組DNA雜交結(jié)合進化樹分析，認為異嗜糖氣單胞菌與維氏氣單胞菌親緣關(guān)系較近[16]。本研究首次從病鲇(Silurussp.)腹水等組織中分離出1株 SJ-2 致病菌，采用理化特性結(jié)合16S rDNA用基因序列分子鑒定為異嗜糖氣單胞菌，并且構(gòu)建進化樹分析顯示與維氏氣單胞菌(A.veronii)親緣關(guān)系較近，這與國外學(xué)者研究結(jié)果[15-16]一致。

研究表明，異嗜糖氣單胞菌做為氣單胞菌屬中新發(fā)現(xiàn)鑒定的一個新種，可以感染鱘(A.schrencki)、鰻(A.japonica)等魚類發(fā)病[7-8]。Yanez等從湖水中分離獲得A34菌株，根據(jù)gyrB基因序列鑒定為異嗜糖氣單胞菌，結(jié)果表明該菌是一種魚類病原菌[17]。最近，國內(nèi)學(xué)者從病魚體內(nèi)被分離到異嗜糖氣單胞菌，而在鲇魚尚未見文獻報道。劉雙鳳等報道異嗜糖氣單胞菌感染史氏鱘(A.schrencki)，發(fā)病初期病魚主要表現(xiàn)為食欲減退、行動遲緩，病重時體表顏色深淺不一，病魚口部四周充血、腫脹，肛門紅腫，剖檢時發(fā)現(xiàn)肝臟質(zhì)地變脆發(fā)白，腸道內(nèi)沒有食物等癥狀[4]。楊求華等從發(fā)病鰻鱺(A.japonica)臟器中分離到異嗜糖氣單胞菌，進行動物感染鰻鱺表現(xiàn)為注射部位潰爛、腫大，腹腔腫大，肛門紅腫外突，死亡率均超過80%，證實異嗜糖氣單胞菌對鰻鱺具有致病性[8]。本研究首次報道異嗜糖氣單胞菌感染鲇，臨床主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、不攝食、體表出血、肛門紅腫突出、腹部膨大，解剖發(fā)現(xiàn)腹腔中有大量血性腹水，腸道無內(nèi)容物、肝臟壞死等癥狀。人工腹腔注射斑馬魚、鲇魚呈現(xiàn)體色變白、腹水等癥狀，這與國內(nèi)學(xué)者等報道該菌感染鱘、鰻等魚類臨床癥狀[7-8]基本一致。但是，異嗜糖氣單胞菌SJ-2菌株感染鲇(Silurussp.)死亡率較低，僅為20%，可能由于異嗜糖氣單胞菌為條件致病菌[11]，也與鲇魚抗病力強有關(guān)[20]。以上研究結(jié)果為魚源異嗜糖氣單胞菌的致病機理研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]楊東霞，曲險峰，楊暑伏.氣單胞菌分類及檢測技術(shù)的研究進展[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2003，13(2)：247-249.

[2]Martin-Carnahan A，Joseph S W，Genus I. Bergey’s manual of systematic bacteriology[M]. Berlin：Springer，2005：557-578.

[3]Martinezmurcia A J，Esteve C，Garay E，et al.AeromonasallosaccharophilaSP-NOV，a new mesophilic member of the genusAeromonas[J]. Fems Microbiology Letters，1992，91(3)：199-206.

[4]Lee J V，Donovan T J. Isolation and identification of microorganisms of medical and veterinary importance[J]. Society for Applied Bacteriology，1985，16：387.

[5]Saavedra M J，Perea V，F(xiàn)ontes M C，et al. Phylogenetic identification ofAeromonasstrains isolated from carcasses of pig as new members of the speciesAeromonasallosaccharophila[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2007，91(2)：159-167.

[6]李欣悅，李鳳娟，杜鵬程，等.rpoD和gyrA基因?qū)鈫伟b定的比較分析[J]. 疾病監(jiān)測，2016，31(3)：200-204.

[7]劉雙鳳，鄒作宇，袁美云，等. 史氏鱘腫嘴病的診斷與防治[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚，2015(1)：57-58.

[8]楊求華. 養(yǎng)殖鰻鱺致病性氣單胞菌的分離與鑒定[D]. 廈門：集美大學(xué)，2012.

[9]胡秀彩，邊延峰，趙臘梅，等. 魚源維氏氣單胞菌的分離鑒定[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34(12)：232-235.

[10]黎 烔，葉 星，盧邁星，等. 羅非魚維氏氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志，2011，32(3)：132-136.

[11]李 莉，陳 穎，張 超，等. 水產(chǎn)動物氣單胞菌鑒定方法研究進展[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2015，34(2)：128-134.

[13]Saavedra M J，F(xiàn)iguera M J. Martínez-Murcia A J. Updated phylogeny of the genusAeromonas[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2006，56(10)：2481-2487.

[14]Esteve C，Gutiérrez M C，Ventosa A.Aeromonasencheleiasp. nov.，isolated from European eels[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1995，45(3)：462-466.

[15]Huys G，Mpfer K，Swings P. New DNA-DNA hybridization and phenotypic data on the speciesAeromonasichthiosmiaandAeromonasallosaccharophila：A.ichthiosmiaSchubert et al. 1990 is a later synonym ofA.veroniiHickman-Brenner et al. 1990[J]. Systematic & Applied Microbiology，2001，24(2)：177-182.

[16]Nhung P H，Hata H，Ohkusu K，et al. Use of the novel phylogenetic marker dnaJ and DNA-DNA hybridization to clarify interrelationships within the genusAeromonas[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57(Pt 6)：1232-1237.

[17]Yanez M A，Catalan V，Apraiz D，et al. Phylogenetic analysis of members of the genusAeromonasbased ongyrBgene sequences[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53(3)：875-883.

[18]Pic?o R C，Poirel L，Demarta A，et al. Plasmid-mediated quinolone resistance inAeromonasallosaccharophilarecovered from a Swiss lake[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2008，62(5)：948-950.

[19]Girlich D，Poirel L，Nordmann P. PER-6，an extended-spectrum beta-lactamase fromAeromonasallosaccharophila[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2010，54(4)：1619-1622.

[20]黃 文，胡慶杰. 懷頭鯰大規(guī)格苗種培育試驗[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚，2014(1)：9.