外源硫化氫通過清除4-HNE抑制肝細胞死亡的分子機制研究

馬旺 丁濱 丁秦超 王萃 任宣奇 竇曉兵★

酒精性肝?。ˋLD）是由于長期過度飲酒導致的肝臟疾病，近年來我國ALD的發(fā)病率及病死率也呈現逐年增長趨勢，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。4-羥基壬烯酸（4-HNE）是肝臟長期暴露于酒精后產生的一種肝細胞致敏因子，其對肝臟蛋白的修飾會促進ALD的形成，在ALD 的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用［1］。近年來研究證實，H2S以4-HNE為靶點具有治療多種疾病的潛質［2-3］。但是H2S和4-HNE 的相關研究在肝病中未見報道。本研究旨在證明是否可以通過補充外源H2S，進而通過清除4-HNE，從而抑制肝細胞死亡。在本研究中以人的肝癌細胞系HepG2為細胞模型，進行細胞培養(yǎng)及藥物干預，通過MTT法﹑LDH活性檢測﹑ELISA以及Western Blot技術探究H2S對4-HNE誘導肝細胞死亡的抑制作用及分子機制，為在體內動物實驗水平闡明ALD的發(fā)生發(fā)展過程提供新的思路，為ALD的臨床治療提供新的策略，也為以4-HNE為靶點的新型藥物的研發(fā)提供重要的理論指導和依據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料與試劑 細胞：人肝癌細胞HepG2購自中科院上海細胞庫。試劑：4-HNE購自Cayman Chemical公司；β-Actin 抗體購自武漢博士德公司；4-HNE抗體購自R&D公司；H2S檢測試劑盒購自上海橋杜生物有限公司；LDH細胞毒性檢測試劑盒購自Thermo scientific；其他實驗試劑均購自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法 （1）細胞培養(yǎng)及分組：人肝細胞HepG2用含10%胎牛血清﹑青霉素100 U/ml﹑鏈霉素100 mg/L的DMEM培養(yǎng)液于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數生長期的細胞制備人肝癌細胞HepG2單細胞懸液，細胞按2×105個/ml密度接種于24孔培養(yǎng)板內，每孔1ml，分成4組：①空白對照組（UT）：不作任何藥物處理；②4-HNE組：單加20μmol/L 4-HNE處理；③NaHS組：單加0.4mmol/L的NaHS處理；④4-HNE+NaHS組：NaHS預處理2h后再加入4-HNE處理。以上四組每組設3個重復孔，均處理18h。（2）細胞增殖測定（MTT法）：將上述細胞按2×105個/ml密度制備單細胞懸液，每孔200μl接種于96孔培養(yǎng)板內，每組重復6孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行藥物孵育。再加入20μl MTT溶液在培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔中所有培養(yǎng)液，各孔加入150μl DMSO，于搖床上振蕩10min待紫色結晶充分溶解后在酶標儀490nm波長處測定并記錄吸光度值A490。（3）乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測：根據LDH檢測試劑盒說明測定各組細胞培養(yǎng)上清液中LDH水平，分析各組間的藥物對細胞的毒性作用。（4）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞內H2S水平：細胞經藥物干預后用液氮反復凍融及RIPA裂解液裂解從而使得細胞內H2S釋放出來，根據ELISA試劑盒（上海橋杜生物公司）說明書操作，經包被，樣本孵育，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，終止等步驟檢測細胞內H2S水平。（5）蛋白質免疫印跡法（WB）檢測蛋白表達：細胞培養(yǎng)及藥物孵育后，PBS洗滌細胞兩次，加入含有PMSF﹑Na3VO4﹑NaF﹑蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，置冰上裂解≥30min，4℃下以12000r/min離心10 min后取上清液，用BCA試劑盒測定提取液中的蛋白質濃度。將各組調整至同一水平后，以20μg上樣量備樣，經SDSPAGE電泳﹑轉移電泳﹑封閉﹑抗體免疫﹑顯影﹑曝光等步驟檢測蛋白表達情況（以β-actin做內參對照）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外源NaHS（H2S前體）能升高肝細胞內H2S水平 利用H2S ELISA試劑盒檢測HepG2細胞內H2S水平，實驗結果顯示，4-HNE單獨作用HepG2肝細胞時，細胞內H2S水平與對照組比較明顯降低（P＜0.05），若先用0.4mmol/L的NaHS預處理HepG2肝細胞后，發(fā)現細胞內H2S水平顯著升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 外源NaHS（H2S前體）能升高肝細胞內H2S水平

2.2 外源NaHS（H2S前體）顯著抑制4-HNE誘導的肝細胞死亡 通過MTT法檢測的結果顯示，隨著4-HNE濃度升高，其對細胞殺傷作用顯著增強（P＜0.05），見圖2A。用不同濃度NaHS預處理HepG2細胞后結果顯示，隨著NaHS濃度升高，其細胞活性比單獨4-HNE處理組明顯增強（P＜0.05），見圖2B。LDH活性檢測結果表明，用4-HNE單獨作用HepG2細胞時，細胞活性與對照組比較明顯降低（P＜0.05），若先用0.4 mmol/L的 NaHS預處理HepG2細胞后，其細胞活性顯著升高（P＜0.05），見圖2C。

2.3 升高肝細胞內H2S水平可以顯著降低細胞內4-HNE與蛋白質形成的加合物水平 利用Western Blot技術檢測肝細胞內4-HNE與蛋白質形成的加合物水平。結果表明，20μmol/L的4-HNE作用于HepG2肝細胞之后，細胞內4-HNE蛋白質加合物表達增加。用0.4 mmol/L NaHS預處理肝細胞2h后，再加入20 μmol/L的4-HNE孵育1 h，與4-HNE單獨作用組比較，NaHS+4-HNE組細胞內4-HNE蛋白質加合物水平顯著降低，見圖3A和3B。

圖2 補充NaHS（H2S前體）顯著抑制4-HNE誘導的肝細胞死亡。A：不同濃度4-HNE對HepG2肝細胞增殖的影響。（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 20 μmol/L 4-HNE）；B：不同濃度NaHS對HepG2肝細胞增殖影響（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 4-HNE）

圖3 升高肝細胞內H2S水平可以顯著降低胞內4-HNE與蛋白質形成的加合物水平。A： 4-HNE與蛋白質形成的加合物水平；B： 4-HNE與蛋白質形成的加合物水平的條帶灰度值統(tǒng)計（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 4-HNE）

3 討論

肝臟是酒精代謝的主要人體器官，長期的酒精攝入會導致肝細胞發(fā)生氧化應激和脂質過氧化，4-羥基壬烯酸（4-HNE）是酒精誘導肝臟氧化應激的主要產物之一，在ALD的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用。長期大量飲酒可以導致肝臟活性氧族（ROS）增多，誘導氧化應激，生成的4-HNE通過與細胞內的核酸或蛋白質等生物大分子結合形成加合物，改變肝細胞生理狀態(tài)和功能，進而誘發(fā)ALD。1997年，Paradis V等［4］首次報道慢性酒精性肝病患者體內的4-HNE與蛋白質形成的加合物的濃度明顯高于正常人。其后臨床研究﹑流行病學調查及動物實驗均證實，酒精性肝病患者及長期酗酒人群的肝臟及血漿中的4-HNE濃度顯著升高，其與蛋白質形成的加合物的濃度可能與ALD的嚴重程度相關［5-6］。上述研究結果表明，4-HNE是ALD發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的致病因素，然而對于4-HNE如何誘導或加重ALD及其具體機制尚未明確，有待進一步研究。Sampey BP等［7］的研究證明4-HNE可以通過抑制細胞內的ERK﹑Akt等信號轉導通路，誘導肝細胞死亡。而4-HNE是否還可以通過對蛋白質的表觀遺傳學修飾調控其他細胞信號轉導通路引發(fā)或加劇酒精誘導的氧化應激和肝細胞死亡尚未見明確報道。

而H2S參與了多種與4-HNE相關疾病的防治。Zheng-Wei L等［8］發(fā)現抑制內源性H2S的合成可以增加活性氧以及氧化應激相關代謝物的產生，而機體補充外源性的H2S則可以降低活性氧以及氧化應激相關代謝物的產生，并具有一定的抗氧化應激作用。本研究發(fā)現，補充H2S前體NaHS后可檢測到肝細胞內H2S水平顯著升高。MTT法和LDH活性檢測實驗結果顯示，H2S可以抑制4-HNE誘導的肝細胞死亡。由此，推測外源H2S可以抑制肝細胞死亡，然而H2S是否通過清除4-HNE來抑制肝細胞凋亡從而改善ALD尚不可知。

據報道，正常人血漿中4-HNE的生理濃度為0.3～0.7μmol/L，而ALD患者的血漿中4-HNE濃度顯著增加，肝臟的局部細胞為了應對氧化應激，4-HNE濃度甚至可高達100μmol/L［9］。如何降低過量的4-HNE水平，使其恢復至正常水平，保持4-HNE在體內的動態(tài)平衡是防治ALD的關鍵。4-HNE與蛋白質結合形成4-HNE蛋白質加合物是4-HNE發(fā)揮病理作用的主要機制之一，本研究Western blot結果顯示，4-HNE與蛋白質結合并不是某一特定分子量的條帶，而是從15～200KDa之間均會形成4-HNE與蛋白質的加合物，故目前來看，4-HNE與蛋白質的結合并不是特定的，而是與細胞內的蛋白廣泛結合，影響蛋白質的翻譯后修飾。為觀察外源H2S對肝細胞內4-HNE蛋白質加合物表達的影響，用0.4mmol/L H2S前體NaHS預處理肝細胞2h，再加入20μmol/L的4-HNE孵育1h后提取蛋白后進行Western Blot實驗，結果顯示4-HNE作用后細胞內4-HNE蛋白質加合物表達明顯增強，而H2S可顯著抑制其增加。

綜上所述，長期攝入酒精引起肝細胞內4-HNE水平升高，而H2S的前體NaHS可以提高肝細胞內H2S水平，清除4-HNE與蛋白質形成的加合物，從而抑制4-HNE誘導的肝細胞死亡。這將為ALD的臨床治療提供新的策略，也為以4-HNE為靶點的新型藥物研發(fā)提供重要的理論指導和依據。然而，H2S清除肝細胞內4-HNE的確切機制仍有待進一步研究。

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