云南產(chǎn)不同色型瑪咖對(duì)SD雌性大鼠腸道健康的影響

朱玉竹，朱萍

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬中學(xué)，云南昆明650200；2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044）

瑪咖（Lepdium meyenii Walp，Maca）為十字花科（Brassicaceae）獨(dú)行菜屬（Lepidium）草本植物，原產(chǎn)于海拔 3 500 m～4 000 m 的秘魯安第斯山脈（AndesPeru）[1－2]。從2002年我國正式批準(zhǔn)引種瑪咖以來，逐漸形成以云南麗江為中心，逐漸輻射至昭通、會(huì)澤等云南其他地州及吉林、新疆和湖南等多個(gè)省市區(qū)。2011年，國家衛(wèi)生部第31號(hào)公告批準(zhǔn)瑪咖粉作為“新資源食品”，瑪咖迎來了快速發(fā)展期。瑪咖含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、多糖等營養(yǎng)物質(zhì)和瑪咖烯、瑪咖酰胺等生物堿活性成分，是藥食同源作物，具有增強(qiáng)性功能[3－4]、抗疲勞、抗氧化[5]、提高生育力[6]、減緩更年期綜合癥[7]等作用。現(xiàn)已研究表明，云南產(chǎn)不同色型，不同產(chǎn)地的瑪咖在營養(yǎng)物質(zhì)及生理功能上存在差異，如，云南黑、紫、黃、綠瑪咖中多糖含量為紫色（7.02%）＞黑色（6.93%）＞綠色（6.75%）＞黃色（6.53%）[8]；生物堿含量依次為紫色（4.4078mg/g）、白色（2.919 3 mg/g）、黃色（2.224 1 mg/g），差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）[9]；張毅[10]研究表明，云南紫、黃、白瑪咖對(duì)小鼠抗疲勞、非特異性免疫功能、降血脂、缺氧耐受力及抗氧化方面的效果差異，結(jié)果表明紫色瑪咖效果最好，白色瑪咖效果較差。

腸道健康與人體健康關(guān)系密切，現(xiàn)已有大量研究表明腸道菌群與免疫類疾病、胃腸道疾病、糖尿病等存在關(guān)聯(lián)。另外，腸道是口服藥物在體內(nèi)代謝的重要場(chǎng)所[11]，而瑪咖作為一種新的藥食同源植物[12]，其對(duì)腸道健康影響的研究卻非常少。因此研究瑪咖對(duì)腸道微環(huán)境和腸道菌群的影響顯得十分必要。本文以云南產(chǎn)不同色型瑪咖對(duì)SD雌性大鼠腸道微環(huán)境和腸道菌群的影響，為瑪咖的開發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑪咖：云南省剛捷生物科技有限公司購買；SD雌性大鼠，體質(zhì)量150 g～160 g，40只：重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）20120008；基礎(chǔ)飼料：重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供；戊酸、異戊酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸（色譜純）：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；巴豆酸（色譜純）：日本東京天成工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

Light Cycler Nano熒光定量PCR儀：美國羅氏公司；GC－2010高效氣相色譜儀、UV－2450紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；H1MG酶標(biāo)儀：美國基因有限公司；3－18k冷凍離心機(jī)：德國SIGMA公司；S1000梯度PCR儀：美國BIO－RAD公司；Nano Drop 2000微量紫外分光光度：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)樣品的制備與劑量確定

瑪咖作為一種可食用植物，其成人每日推薦攝入量為25 g，中國人平均體質(zhì)量為60 kg，即成人每日用瑪咖劑量為0.42 g/（kg·bw）[13－15]。

將瑪咖切片后于50℃烘干至恒重，經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎后過150目篩。取瑪咖干粉6 g溶于1%羧甲基纖維素鈉溶液并定容至50 mL，即得0.12 g/mL濃度樣品懸浮液，4℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.3.2 動(dòng)物分組和飼養(yǎng)

將40只SD雌性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組，黑瑪咖，紫瑪咖、黃瑪咖、白瑪咖，各組8只。每只大鼠獨(dú)立飼養(yǎng)于（25 cm×15 cm×15 cm）不銹鋼籠里中，動(dòng)物房溫度控制在（25±1）℃，相對(duì)濕度55%，晝夜循環(huán)周期12 h，實(shí)驗(yàn)組每日灌胃0.42 g/（kg·bw）的1%羧甲基纖維素鈉瑪咖干粉（150目）懸浮液，空白組灌胃等體積1%羧甲基纖維素鈉溶液，飼養(yǎng)期間自由采食基礎(chǔ)飼料和飲水飼養(yǎng)，每天記錄一次大鼠采食量，每3 d稱量一次大鼠體質(zhì)量，同時(shí)調(diào)整灌胃量，喂養(yǎng)28 d，禁食12 h后稱重。乙醚麻醉后斷頭處死，解剖。取出盲腸組織，稱重后，縱向剖開，取100 g盲腸內(nèi)容物于1.5 mL無RNA酶離心管中，保存于－80℃用于盲腸內(nèi)容物中菌群的測(cè)定，收集剩余的盲腸內(nèi)容物保存于－20℃冰箱，備用。用4℃生理鹽水清洗盲腸壁，吸水紙吸干，稱重后并計(jì)算其表面積。

1.3.3 飼料效率的測(cè)定

1.3.4 盲腸壁面積測(cè)定

參考葉敏等[17]方法進(jìn)行盲腸壁面積的測(cè)定，用4℃生理鹽水將盲腸壁洗凈后，在劃有標(biāo)準(zhǔn)刻度的坐標(biāo)紙上充分展開后，鉛筆勾畫出其輪廓，待坐標(biāo)紙干燥后復(fù)印于打印紙上，剪下輪廓圖，電子天平精密稱量輪廓紙的質(zhì)量A1（g），以及1cm2打印紙的質(zhì)量A0（g/cm2），并按以下公式計(jì)算。

1.3.5 pH 值測(cè)定

稱取一定質(zhì)量的盲腸內(nèi)容物于10 mL去離子水預(yù)處理離心管中，加入質(zhì)量與體積為1∶10去離子水，旋渦1min，靜置2min，測(cè)上清液pH值。

1.3.6 短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.2 g盲腸內(nèi)容物另入10 mL離心管中，另入2 mL含有5 mmol/L巴豆酸的10 mmol/L氫氧化鈉溶液，4℃，4 000 r/min離心15min，吸取上清液于5 mL離心管中；4℃，10 000 r/min離心15min，吸取上清液 1 mL，過濾（0.25 μm）至 2 mL 進(jìn)樣小瓶中待測(cè)[4]。

氣相色譜條件：柱流量 0.95mL/min，進(jìn)樣量 1μL，進(jìn)樣口溫度220℃，柱溫90℃、平衡時(shí)間0.5min，5℃/min升溫至150℃，保留時(shí)間7min；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min，檢測(cè)器溫度 230℃[5]。

1.3.7 游離氨含量測(cè)定

將1.3.5預(yù)處理的盲腸內(nèi)容物樣品于4℃，4 000 r/min離心5min，吸取上清液1 mL，依次加入1 mL含有0.001 mol/L Na2Fe（CN）5NO·2H2O 的 0.5 mol/L 苯酚溶液和 1 mL 含有 0.03 mol/L NaClO 的 0.625 mol/L NaOH溶液，60℃保溫5min，625 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[10]。

1.3.8 盲腸內(nèi)容物微生物的測(cè)定

按照糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有效公司）的說明書進(jìn)行提取。參照文獻(xiàn)[18]設(shè)計(jì)各腸道菌群聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物，并由華大基因合成，引物序列及擴(kuò)增片段見表1。反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT－PCR）反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Green Supermix（Bio－Rad 公司）4.2 μL，20 μmol/L上、下游引物各 0.3 μL；焦炭酸二乙酯（oiethy pyrocarbonate，DEPC）水 4.2 μL，100 ng/μL cDNA 模板 1.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；40次循環(huán)包含95℃5 s；60℃30 s；65℃5 s；95℃5 s。計(jì)算出各種細(xì)菌的Ct值。

表1 各細(xì)菌引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and product lengths of different bacteriabp

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示，各組間差異顯著性采用SPSS 16.0軟件分析，各組間比較采用單因素方差分析，用Duncan法分析顯著性，P＜0.05被認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、采食量及飼料效率的影響

瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠采食量、體質(zhì)量增加量及飼料效率的影響見表2。

表2 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠采食量、體質(zhì)量增加量及飼料效率的影響（n=8）Table 2 The effects of Maca on feed intake，weight gain and feed efficiency in SD female rats（n=8）

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，黑瑪咖，紫瑪咖，黃瑪咖和白瑪咖均可增加實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量，其中黑瑪咖，紫瑪咖和黃瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量的增加量影響顯著（P＜0.05），體質(zhì)量增加大小排序分別為：黑瑪咖＞紫瑪咖＞黃瑪咖＞白瑪咖；不同組別瑪咖均有降低實(shí)驗(yàn)大鼠采食量的趨勢(shì)，其中黑瑪咖和紫瑪咖可顯著（P＜0.05）降低實(shí)驗(yàn)大鼠采食量。不同組別瑪咖均可提高實(shí)驗(yàn)大鼠飼料效率，其中黑瑪咖，紫瑪咖和黃瑪咖可顯著（P＜0.05）提高實(shí)驗(yàn)大鼠飼料效率。

2.2 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸及其微環(huán)境的影響

瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸及其微環(huán)境的影響見表3。

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均有降低實(shí)驗(yàn)大鼠肓腸總質(zhì)量的趨勢(shì)，其中黑瑪咖和紫瑪咖降低效果顯著（P＜0.05）；黑瑪咖，紫瑪咖和黃瑪咖顯著（P＜0.05）增加實(shí)驗(yàn)大鼠肓腸壁質(zhì)量，白瑪咖也有增加實(shí)驗(yàn)大鼠肓腸壁質(zhì)量的作用，但不顯著（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組均有增加實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸壁表面積的趨勢(shì)，其中澤黑瑪咖和紫瑪咖可顯著（P＜0.05）增加實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸壁面積。與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均有降低實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物pH值和游離氨的作用，其中澤黑瑪咖和紫瑪咖可顯著（P＜0.05）降低實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物pH值和游離氨含量；各實(shí)驗(yàn)組均有升高實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物含水量的趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸及其微環(huán)境的影響（n=8）Table 3 The effects of Maca on cecum and its microenvironment in SD female rats（n=8）

2.3 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響

瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響見表4。

表4 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響（n=8）Table 4 The effects of Maca on short chain fatty acids of cecal contents in SD female rats（n=8）μmol/g

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均可顯著（P＜0.05）升高實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中乙酸的含量，分別升高了 40.30%、27.77%、21.76%和 22.61%；有升高實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中丙酸和丁酸含量的趨勢(shì)，其中黑瑪咖、紫瑪咖和黃瑪咖可著升高（P＜0.05），其中丙酸的含量分別升高了 19.88%、12.09%、9.44%和3.07%，丁酸的含量分別升高了 20.14%、17.26%、9.83%和1.19%；而各實(shí)驗(yàn)組對(duì)戊酸、異丁酸和異戊酸含量的影響有降低的趨勢(shì)，其中黑瑪咖對(duì)異戊酸含量有顯著（P＜0.05）降低，其它各組均不顯著（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組均可升高實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸（short－chain fatty acids，SCFA）的含量，其中黑瑪咖和紫瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中SCFA含量影響顯著（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組 SCFA 含量分別升高了 16.30%、11.24%、7.90%和 6.75%；各實(shí)驗(yàn)組均有降低實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中支鏈脂肪酸（branched chain fatty acid，BCFA）含量的趨勢(shì)，但不顯著（P＞0.05）。

2.4 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響

瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響見表5。

表5 瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響（n=8）Table 5 The effects of Maca on microorganisms of cecal contents in SD female rats（n=8）log10 copies/g

由表5可知，與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組腸球菌數(shù)量降低，其中黑瑪咖、紫瑪咖和黃瑪咖降低量顯著（P＜0.05），而白瑪咖對(duì)腸桿菌同樣有降低趨勢(shì)的影響，但不顯著（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組有升高乳酸桿菌和擬桿菌數(shù)量的趨勢(shì)，但不顯著（P＞0.05）；各實(shí)驗(yàn)組均有升高實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌和梭菌數(shù)量的趨勢(shì)，其中黑瑪咖和紫瑪咖影響顯著（P＜0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的主要目的是探討云南產(chǎn)不同色型瑪咖對(duì)SD雌性大鼠腸道健康的影響。在機(jī)體運(yùn)動(dòng)量與基礎(chǔ)代謝量一致的條件下，大鼠體質(zhì)量、采食量和飼料效率可間接反映食物在胃腸道內(nèi)消化吸收情況，灌胃瑪咖后，大鼠的體質(zhì)量和飼料效率增加，而采食量卻有降低，說明瑪咖能夠促進(jìn)飼料的消化利用率，可能與瑪咖中的膳食纖維含量有關(guān)，瑪咖是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)膳食纖維和蛋白質(zhì)原料來源，研究表明，云南產(chǎn)黑瑪咖和黃瑪咖中膳食纖維含量達(dá)37.41%和33.46%，而粗蛋白質(zhì)含量分別為14.74%和 12.48%[19－20]。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）的組成和總量可以間接反應(yīng)機(jī)體腸道內(nèi)厭氧菌的數(shù)量和代謝情況，SCFA是由腸道菌群利用宿主不易消化的糖類、蛋白或內(nèi)源性底物等酵解而產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物[21]，可促進(jìn)盲腸壁生長(zhǎng)，表面積擴(kuò)大，質(zhì)量上升?，斂е泻胸S富的淀粉、多糖等碳水化合物，為腸道菌群提供了良好的原料基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑪咖可降低實(shí)驗(yàn)大鼠肓腸總質(zhì)量，有增加肓腸壁質(zhì)量和表面積的趨勢(shì)，其中黑瑪咖和紫瑪咖作用效果顯著（P＜0.05）。糞便含水率增加可增加有毒物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的及時(shí)排出體外，減少其在腸道中的停滯時(shí)間，維持腸道健康有著重要的作用[22]。研究表明，腸道中雙歧桿菌下降，大腸桿菌和梭菌大量繁殖，合造尿總堿合成受阻，產(chǎn)生更多的氨[23]。與空白對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均有降低實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物pH值和游離氨的作用，其中黑瑪咖作用顯著（P＜0.05）；各實(shí)驗(yàn)組均有升高實(shí)驗(yàn)大鼠盲腸內(nèi)容物含水量的趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

SCFA主要包括乙酸、丙酸、丁酸等6個(gè)及以下碳原子組成的有機(jī)酸，其中乙酸、丙酸和丁酸，約占SCFA總量的90%～95%[24]。SCFA不僅是腸道上皮細(xì)胞的主要能量物質(zhì)，還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，減少促炎因子的生成，修復(fù)粘膜炎癥，改善腸道功能、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等多種作用。而人體腸道細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生SCFA的能力又受腸道菌數(shù)量、pH值及底物的影響[25－26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑪咖干粉均能增加小鼠肓腸內(nèi)容物中SCFA的含量，對(duì)腸道起一定的保護(hù)作用，其中黑瑪咖和紫瑪咖對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肓腸內(nèi)容物中SCFA的影響顯著（P＜0.05）大于黃瑪咖和白瑪咖。

雙歧桿菌作為腸道中重要的生理菌群，能大量合成動(dòng)物所需的營養(yǎng)物質(zhì)和維生總堿，對(duì)多種腸道病原微生物產(chǎn)生拮抗，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)腸道菌群，抗腫瘤，抗衰老等功能[27－28]。黑瑪咖和紫瑪咖能顯著促進(jìn)盲腸中雙歧桿菌的生長(zhǎng)，而抑制腸球菌的生長(zhǎng)；各實(shí)驗(yàn)組有升高乳酸桿菌和擬桿菌數(shù)量的趨勢(shì)。說明黑瑪咖和紫瑪咖能促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，抑制腸道有害菌的生長(zhǎng)

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食用瑪咖對(duì)機(jī)體腸道健康是有益的，其中黑瑪咖和紫瑪咖對(duì)腸道健康的影響效果顯著高于黃瑪咖和白瑪咖。但瑪咖粉碎粒度、營養(yǎng)成分、產(chǎn)地及其食用時(shí)間對(duì)腸道健康的影響及其機(jī)理有待深入研究。

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