一株產(chǎn)紅色素真菌的鑒定及其色素性質(zhì)的研究

付金菊，王強(qiáng)，陳玉龍，楊清香

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007）

目前，色素在食品和飼料行業(yè)中的應(yīng)用日益劇增，具有廣闊的市場前景。天然提取色素主要來源于有色植物，受到原料等因素的制約，植物色素含量低、品質(zhì)差異大，價(jià)格昂貴[1]。人工合成色素的安全性向來受到爭議，難以在食品領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。利用微生物生產(chǎn)色素不僅克服了上述困難，而且微生物色素通常比植物或動(dòng)物源色素具有更高的穩(wěn)定性和溶解性[2]。因此，利用微生物生產(chǎn)色素受到了越來越多研究者的關(guān)注。在產(chǎn)色素的微生物中，絲狀真菌色素含量高，易培養(yǎng)，成為微生物色素的重要來源，已報(bào)道的真菌色素近600種，如紅曲紅色素、類胡蘿卜素、蝦青素等[3]。真菌色素不僅在化學(xué)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出多樣性，而且擁有豐富多彩的顏色，是主要的產(chǎn)色素微生物[4]。真菌不僅能在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生色素，在液體培養(yǎng)基中同樣能產(chǎn)生大量色素，適宜于規(guī)?；a(chǎn)[5]。然而，目前具有市場應(yīng)用價(jià)值的微生物源色素依然有限，尋找有價(jià)值的色素仍然任重道遠(yuǎn)。

本研究從三孢布拉霉培養(yǎng)過程中的污染平板上篩選得到一株產(chǎn)紅色素的絲狀真菌，初步判斷該色素與番茄紅素完全不同。為了進(jìn)一步挖掘該絲狀真菌產(chǎn)紅色素的潛在價(jià)值，我們對(duì)該真菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)該紅色素進(jìn)行了提取和初步分離，以及對(duì)常見物理化學(xué)因素的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌株的培養(yǎng)

培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基、pH值自然[6]。

平板培養(yǎng)：將保藏于20%甘油里的菌液接種于6°麥芽汁固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4 d。

發(fā)酵液培養(yǎng)：無菌條件下，用接種環(huán)從培養(yǎng)好的平皿中挑取一環(huán)接種于6°麥芽汁液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)5 d。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；LRX系列生化培養(yǎng)箱：上海恒科有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械廠；離心機(jī)（5415R）：德國EPPENDORF公司；電泳儀：Powerpac USA；超凈工作臺(tái)：AIR TECH蘇州凈化設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS－3781L－PS）：松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；紫外可見分光光度計(jì)（UV2600）：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

從培養(yǎng)的單菌落上挑取適量的菌體，用Takara微生物細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，以細(xì)胞裂解液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以ITS序列通用引物ITS1、ITS4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[7]。各引物序列如下：ITS1（5′TCCGTTAGGTGAACCTGCGG3′），ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）所有引物均由上海生工公司合成。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：25 μL的總反應(yīng)體積中包含1 μL DNA模板，每個(gè)引物 0.8 μL，12.5 μL Mix，加水至 25 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（細(xì)菌 94℃ 40 s，55℃ 90 s，72℃ 90 s；真菌 94℃ 30 s，54℃30 s，72℃1min），最后72℃延伸10min，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。將目的片段的PCR產(chǎn)物送到上海生工公司進(jìn)行測序，利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中18S rRNA基因和真菌ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，通過MEGA4.1軟件對(duì)同源序列以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用Neighbor－Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹法，確定菌株的分類水平。

1.4 產(chǎn)色素真菌的發(fā)酵曲線的測定

配30瓶發(fā)酵液，每瓶接種2 mL濃度為107個(gè)/mL的孢子懸液。從發(fā)酵開始，每隔12小時(shí)取3瓶發(fā)酵液，離心，上清液在495 nm波長下測定紅色素的吸光值。菌絲體用洗滌3次，105℃烘干至恒重，即為生物量。

1.5 紅色素的提取

將菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，取25 mL發(fā)酵液，8 000 r/min 離心 10min，取上清液，使用 0.45 μm膜過濾，留下濾液。將紅色素提取液分別與等體積的乙醇，乙酸乙酯，石油醚混合，充分搖勻后靜置，觀察互溶情況。

1.6 全波長光譜掃描與高效液相色譜分析

將發(fā)酵120 h的發(fā)酵液過0.45 μm濾膜后，利用紫外可見分光光度計(jì)－UV2600對(duì)濾液進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收波長。

色素成分分析采用高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm）。流動(dòng)相為乙腈 ∶水=60∶40，流速1 mL/min，檢測波長為495 nm。

1.7 紅色素穩(wěn)定性檢測

用蒸餾水將紅色素適當(dāng)稀釋，直到其吸光度范圍在0.3～0.8之間，記下此時(shí)的吸光度，稀釋過的色素用于色素的穩(wěn)定性檢測。

1.7.1 pH 值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于9支試管中，用氫氧化鈉和鹽酸將色素溶液調(diào)成不同的pH值，靜置30min后，在波長為495 nm處測定色素吸光度。

1.7.2 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于5支試管中，置于 20、40、60、80、100℃下的恒溫水浴鍋中，每個(gè)溫度下處理30min后拿出，在波長495 nm下檢測吸光度。

1.7.3 光照時(shí)間對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，分別置于自然光和紫外光下，照射 0、2、4、6、8、10 h 后，在波長為495 nm下測定其吸光度。

1.7.4 過氧化氫對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，向試管中各添加 0、1、2、3、4、5 mL 10%的過氧化氫溶液，然后用蒸餾水定容至10 mL，充分震蕩后靜置2 h，在波長為495 nm處檢測吸光度。

1.7.5 亞硫酸鈉對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，向試管中各添加 0、1、2、3、4、5 mL 10%的亞硫酸鈉溶液，然后定容至10 mL，震蕩后靜置2 h，在波長為495 nm處檢測吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)色素真菌的分離純化及形態(tài)特征

在培養(yǎng)產(chǎn)番茄紅素的三孢布拉霉固體平板上污染一株霉菌，其菌落周圍出現(xiàn)紅色，其菌絲特征和產(chǎn)生的紅色素在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散特征均明顯不同于三孢布拉霉菌及其產(chǎn)生的番茄紅素。將該菌株分離純化，菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 產(chǎn)紅色素真菌的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of red-pigment-producing fungi

從菌落形態(tài)上判斷，該霉菌與三孢布拉霉具有很大差異，菌落表面呈深綠色，并且向周圍培養(yǎng)基中滲透大量紅色素。而三孢布拉霉的菌落呈黃色，并且不會(huì)向周圍培養(yǎng)基中滲透色素。因此，該霉菌很可能是一株分泌胞外色素的真菌，具有潛在的價(jià)值，值得進(jìn)一步對(duì)菌種和所產(chǎn)色素進(jìn)行鑒定。

2.2 產(chǎn)色素真菌的分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步鑒定該產(chǎn)色素真菌，擴(kuò)增該真菌核糖體rRNA基因的IT1－IT4序列，并測序，將該序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性較高的序列，并使用Neighbor－Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。

從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，菌株YW1的IT1－IT4序列與踝節(jié)菌屬（Talaromyces）的產(chǎn)紫踝節(jié)菌（Talaromyces purpurogenum）在發(fā)育樹上聚為一簇，具有99%的相似性。因此，本研究將該產(chǎn)色素真菌命名為T.purpurogenum YW1。

圖2 產(chǎn)色素真菌YW1的Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of T.purpurogenum YW1（Neighbor-joining）

2.3 產(chǎn)色素真菌的發(fā)酵曲線

產(chǎn)色素真菌的的生長過程曲線和紅色素的合成過程曲線如圖3所示。

圖3 產(chǎn)色素真菌的發(fā)酵曲線Fig.3 Fermentation curve of pigment fungi

從圖3中可以看出，該產(chǎn)色素真菌的生長速度較快，經(jīng)過短暫的適應(yīng)期后，在發(fā)酵48 h生物量達(dá)到最大值[（13.51±1.22）g/L]，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期，并在96 h后生物量開始緩慢下降。紅色素的合成是在發(fā)酵36 h后開始，在48 h～96 h內(nèi)快速合成，隨后保持穩(wěn)定。從發(fā)酵曲線可以看出，紅色素的合成是在霉菌進(jìn)入穩(wěn)定期后開始的，是霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這與大多數(shù)真菌色素相似。

2.4 紅色素的提取和分離

2.4.1 紅色素在不同溶劑中的溶解性

為了確定合適的提取溶劑，本研究將發(fā)酵液與不同極性的有機(jī)溶劑混合，靜置分層后，出現(xiàn)了不同的分層情況。在極性較弱的石油醚中，明顯的分為兩層，色素集中在水相，有機(jī)相中幾乎沒有顏色。當(dāng)發(fā)酵液與乙酸乙酯互溶后，有機(jī)相中呈現(xiàn)黃色，水相為紅色。當(dāng)發(fā)酵液與極性較大的乙醇互溶后，沒有出現(xiàn)分層，色素均勻的分布在溶液中。據(jù)此可以推測，該紅色素是具有較強(qiáng)的極性，可能是多種色素混合在一起，且主要為水溶性色素。水作為色素提取溶劑，不僅無毒、價(jià)格低廉，而且操作簡單，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)越于三孢布拉霉產(chǎn)生的番茄紅素的提取。通過對(duì)發(fā)酵液離心，得到的菌絲體用水洗滌5次，菌絲體接近無色，說明色素為胞外產(chǎn)物。與三孢布拉霉產(chǎn)生的番茄紅素相比較，減少了細(xì)胞破壁過程，大大節(jié)約了時(shí)間和色素提取成本。

2.4.2 色素的光譜吸收特征和組分分析

將發(fā)酵液過0.45 μm濾膜后，利用紫外可見分光光度計(jì)－UV2600對(duì)濾液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果如圖4（a）所示。從掃描結(jié)果可以看出，有兩個(gè)峰值，說明色素成分不是單一的，但在波長為495 nm時(shí)得到最大吸收峰。為了進(jìn)一步對(duì)色素的成分進(jìn)行分離，本研究利用高效液相色譜對(duì)紅色素進(jìn)行分離，結(jié)果如圖4（b）所示。

圖4 紅色素的全波長掃描及高效液相色譜分離Fig.4 Whole wavelength scanning and HPLC of red pigment

2.5 理化因素對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響

用蒸餾水將發(fā)酵液適當(dāng)?shù)狡湮舛确秶?.3～0.8之間，進(jìn)而對(duì)稀釋后的色素進(jìn)行pH值、溫度、光照時(shí)間、氧化還原性等性質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測。以上理化因素對(duì)紅色素穩(wěn)定性的影響如圖5所示。

圖5 理化因素對(duì)色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of physical and chemical factors on pigment stability

2.5.1 pH 值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

pH值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響如圖5（a）所示，在pH值為5.5時(shí)，測得的OD值最高。但值得注意的是，在強(qiáng)酸（pH1.34）和強(qiáng)堿（pH11.71）的條件下，該色素的吸收分別達(dá)到最大吸收峰的74.83%和76.44%，說明該色素具有很好的酸堿穩(wěn)定性。

2.5.2 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將色素置于不同溫度下處理30min，測定其在495 nm下的吸光值，結(jié)果如圖5（b）所示。雖然隨著溫度的升高，測得的吸光值有所下降，但整體的下降速度和下降幅度并不大。當(dāng)溫度從20℃升高的100℃時(shí)，色素的吸光值從0.74下降到0.62，下降幅度僅為16.2%。因此，該色素具有較好的熱穩(wěn)定性，可適用于溫度較高的環(huán)境。

2.5.3 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

將色素分別置于自然光和紫外線下處理不同時(shí)間，測定其在495 nm下的吸光值，結(jié)果如圖5（c）所示。隨著光照時(shí)間的增加，色素溶液OD值略微減小，但與對(duì)照相比，6 h內(nèi)色素的OD值下降并不顯著。這說明該色素在自然光和紫外線的照射下，含量穩(wěn)定。

2.5.4 氧化劑、還原劑對(duì)色素分解的作用

將色素分別置于不同濃度的過氧化氫和亞硫酸鈉溶液中處理2 h，測定其在495 nm下的吸光值，結(jié)果如圖5（d）所示。在低濃度的過氧化氫溶液中，該色素溶液的OD值就迅速下降，隨著過氧化氫濃度的增加，OD值進(jìn)一步下降。在較低亞硫酸鈉溶液中，色素的OD值就明顯下降，但隨著亞硫酸鈉的濃度進(jìn)一步升高，色素的OD值保持穩(wěn)定。這可能是因?yàn)樵摷t色素不是單一的成分，而是含有多種色素，其中的一種或者多種色素對(duì)過氧化氫和亞硫酸鈉較為敏感。

3 結(jié)論與討論

雖然真菌色素種類很多，但真正具有商業(yè)化價(jià)值的色素較少，尤其食品和化妝品行業(yè)對(duì)新型天然色素的需求仍然較大。三孢布拉霉是工業(yè)上生產(chǎn)番茄紅素的主要菌種，菌落呈黃色或者紅色，所產(chǎn)生的番茄紅素是一種脂溶性的胞內(nèi)色素，具有抗氧化、抗衰老等生理功能。而從三孢布拉霉污染平板上分離得到的這株霉菌無論從菌落形態(tài)還是所產(chǎn)色素，都與原菌大為不同。經(jīng)鑒定，該菌株為產(chǎn)紫踝節(jié)菌（T.purpurogenum）。踝節(jié)菌屬（Talaromyces）是 1955年 Benjamin將青霉屬（Penicillium）中的部分菌株歸類后定義的，現(xiàn)在產(chǎn)紫踝節(jié)菌（T.purpurogenum）在命名上仍與產(chǎn)紫青霉（P.purpurogenum）同用[8]。該真菌不僅能夠產(chǎn)生天然紅色素[9]，還能夠產(chǎn)生木聚糖酶、纖維素酶等[10-11]，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有重要作用。已報(bào)道的該真菌所產(chǎn)的色素為紅曲色素的氨基衍生物PP-V[（10Z）-12-carboxyl-monascorubramine][12]，但并沒有關(guān)于該色素功能的研究，并且本研究所獲得的色素從液相圖譜看，其出峰時(shí)間與常用的色素番茄紅素、紅曲紅胺均不同，但是否為PP-V目前還不確定。未來需要對(duì)該色素進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

相比三孢布拉霉等菌株，產(chǎn)紫踝節(jié)菌在用于色素的生產(chǎn)具有諸多優(yōu)勢，如營養(yǎng)需求簡單，生長速度快，不易受到污染，色素產(chǎn)量高等。三孢布拉霉的培養(yǎng)需要正、負(fù)兩種菌株同時(shí)存在才能大量合成色素，并且菌絲濃度高、需氧量高，在放大培養(yǎng)過程中產(chǎn)量急劇下降[6，13]。而產(chǎn)紫踝節(jié)菌僅需要一種菌就能合成大量的紅色素，培養(yǎng)更容易，產(chǎn)量更穩(wěn)定。另外，產(chǎn)紫踝節(jié)菌產(chǎn)生的色素為胞外產(chǎn)物，色素產(chǎn)量提升潛力大，而且也降低了提取成本。作為水溶性的紅色素，不僅具有廣泛的應(yīng)用范圍，而且在提取過程中不需要使用有機(jī)溶劑，即節(jié)約成本，又減少了環(huán)境污染[14]。因此，無論是菌株還是所產(chǎn)的紅色素，都比三孢布拉霉和番茄紅素更易于工業(yè)化。該紅色素的穩(wěn)定性結(jié)果表明，一般的理化因素對(duì)其影響不大，但氧化劑和還原劑對(duì)其有一定的降解作用。這說明該紅色素雖然不及番茄紅素的抗氧化性強(qiáng)，但可能也具有一定的抗氧化性，并且性質(zhì)更穩(wěn)定，更適用于產(chǎn)品的著色劑等。然而，該紅色素的結(jié)構(gòu)和功能，以及該產(chǎn)紫踝節(jié)菌是否產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物還需進(jìn)一步的鑒定，實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)仍需更多的研究。

綜上所述，本研究從三孢布拉霉污染平板上分離得到了一株能夠產(chǎn)生水溶性紅色素的霉菌，經(jīng)鑒定，該真菌為產(chǎn)紫踝節(jié)菌。菌株在生長的穩(wěn)定期（48 h發(fā)酵）產(chǎn)生紅色素，到發(fā)酵第120 h產(chǎn)量最大。紅色素經(jīng)過水提取后，在495 nm處具有最大吸收峰，經(jīng)液相色譜分析，該紅色素為復(fù)合色素，由4種以上的單色素組成，但與目前常用的番茄紅素、紅曲紅胺等在液相色譜中的出峰時(shí)間均不同；該色素具有對(duì)紫外線等光照不敏感，耐高溫、在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿條件下都具有很好的穩(wěn)定性，并且為胞外水溶性分泌物，因此具有很好的開發(fā)價(jià)值。但需要進(jìn)一步對(duì)其生理功能、結(jié)構(gòu)以及毒性進(jìn)行深入研究。

[1]Shahid M,Mohammad F.Recent advancements in natural dye applications:a review[J].Journal of Cleaner Production,2013,53(1):310-331

[2]Kumar A,Vishwakarma H S,Singh J,et al.Microbial pigments:production and their applications in various industries[J].International Journal of Pharmaceutical,Chemical&Biological Sciences,2015,5(1):203-212

[3]Gill M,Steglich W.Pigments of fungi(Macromycetes)[J].Natural product reports,2003,20(6):615-639

[4]J。zlová P,Martinkova L,Ken V.Secondary metabolites of the fungus Monascus:a review[J].Journal of Industrial Microbiology,1996,16(3):163-170

[5]Sayyed I,Majumder D R.Pigment production from fungi[J].International Journal Current Microbiology Applied Sciences,2015,2(1):103-109

[6]王強(qiáng),余曉斌.三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2015,42(2):420-426

[7]桓明輝,李楊,劉曉輝,等.1株產(chǎn)纖維素酶木霉菌種的鑒定[J].微生物學(xué)雜志,2012,32(5):65-68

[8]Samson R A,Houbraken J,Thrane U,et al.Food and indoor fungi CBS laboratory manual series 2[J].Utrecht:CBS-Fungal Biodiversity Centre,2010,2(1):276-390

[9]Yilmaz N,Houbraken J,Hoekstra E S,et al.Delimitation and characterisation of Talaromyces purpurogenus and related species[J].Persoonia,2012,29(12):39-54

[10]Steiner J,Socha C,Eyzaguirre J.Culture conditions for enhanced cellulase production by a native strain of Penicillium purpurogenum[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,1994,10(3):280-284

[11]Belancic A,Scarpa J,Peirano A,et al.Penicillium purpurogenum produces several xylanases:purification and properties of two of the enzymes[J].Journal of Biotechnology,1995,41(1):71-79

[12]Arai T.Importance of the ammonia assimilation by Penicillium purpurogenum in amino derivative Monascus pigment,PP-V,production[J].Amb Express,2013,3(1):19-25

[13]Mantzouridou F,Tsimidou M Z.Lycopene formation in Blakeslea trispora.Chemical aspects of a bioprocess[J].Trends in Food Science&Technology,2008,19(7):363-371

[14]You T T,Zhou S K,Wen J L,et al.Chemical composition,properties,and antimicrobial activity of the water-soluble pigments from Castanea mollissima shells[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2014,62(8):1936-1944