基于功能磁性材料的細(xì)菌富集與鑒別

黃艷玲，張澤生，閆爽

（1.天津科技大學(xué)，天津300457；2.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300350；3.天津廣播電視大學(xué)，天津300350）

面對當(dāng)前嚴(yán)峻的食品安全問題，食源性致病菌的快速分析與鑒別已經(jīng)成為多學(xué)科研究的熱點(diǎn)[1]。由于傳統(tǒng)微生物分析的耗時(shí)費(fèi)力的不足，許多新技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到微生物的分析與鑒別。首先，基于質(zhì)譜技術(shù)分析方法使微生物快速分析成為可能，特別是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS），其使用方法簡單、快速、精確和低成本，現(xiàn)已成為微生物分類鑒別的重要工具[2]。當(dāng)前，利用MALDI-TOF MS分析微生物主要有兩種方法分別是數(shù)據(jù)庫法與生物信息學(xué)法[3]。數(shù)據(jù)庫鑒別法就是把待檢測微生物與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，滿足閾值后來確定待測菌的種屬[4]。生物信息學(xué)法就是利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白數(shù)據(jù)庫對微生物蛋白標(biāo)志物進(jìn)行比對，從而對微生物進(jìn)行分類鑒別。該方法中利用完整核糖體蛋白標(biāo)志物鑒別微生物已被廣泛報(bào)道。Tanigawa[5]利用核糖體蛋白通過搜索核糖體蛋白鑒別數(shù)據(jù)庫對25個(gè)乳酸乳球菌菌株進(jìn)行鑒別。

另外，為了提高M(jìn)ALDI-TOF MS檢測效率，功能性納米材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物的富集與鑒別，功能性納米材料的富集可提高質(zhì)譜檢測的檢測限與檢測效率。這些納米材料主要是通過在納米Fe3O4微粒表面固定靶向作用分析對微生物進(jìn)行選擇性富集，主要包括抗體[6-8]、核酸適配體[9]、生物蛋白[10]、糖類物質(zhì)[11]。從而促進(jìn)微生物的分離鑒別。由于大腸桿菌O157：H7是一株重要的食源性致病菌，本文通過開發(fā)一種簡單、成本低的NH2-Fe3O4磁性顆粒，對大腸桿菌O157：H7進(jìn)行快速富集，然后利用MALDI-TOF MS對其進(jìn)行快速檢測，再利用核糖體蛋白庫對大腸桿菌O157：H7進(jìn)行鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FeCl·36H2O、FeSO·47H2O、Na2HPO·412H2O、NaH2PO·42H2O、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲苯、氨水：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；四乙氧基硅烷（TEOS）、γ-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）：武漢大學(xué)有機(jī)硅新材料股份有限公司；TSB培養(yǎng)基和瓊脂粉：北京奧博星生物制品有限公司；α-腈基-4-羥基苯丙烯酸（CHCA）：Bruker Daltonics；三氟乙酸（TFA：色譜純）：J.T.Baker；乙腈（ACN：色譜純）：J.T.Baker。

超聲清洗器：寧波新芝生物公司；MALDI TOF MS/MS：spectrometer，Autoflex III Bruker Daltonics；Milli-Q水純化系統(tǒng)：Millipore，Milford，MA；振蕩培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；磁性分離器：DYNAL?invitrogen；紫外－可見吸收分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope S4800 SEM）：日立（中國）有限公司；LDJ 9600-1振動樣品磁強(qiáng)度計(jì)：深圳市泰立儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NH2-Fe3O4磁性顆粒的合成

NH2-Fe3O4磁性顆粒的合成按照Fan[12]報(bào)道的方法。

1.2.2 NH2-Fe3O4磁性顆粒的表征

掃描電鏡圖像（SEM）表征NH2-Fe3O4磁性顆粒形貌特征。紅外光譜譜圖的采集是通過傅里葉變換紅外光譜儀采用壓片法對NH2-Fe3O4磁性顆粒的官能團(tuán)進(jìn)行分析。NH2-Fe3O4磁性顆粒的磁性是在室溫條件下通過LDJ 9600-1振動樣品磁強(qiáng)度計(jì)對材料的磁性進(jìn)行表征。

1.2.3 大腸桿菌O157：H7的富集

在37℃下，大腸桿菌O157：H7接種于25 mL滅菌TSB培養(yǎng)基中，搖床120 r/min培養(yǎng)16 h后，1 mL細(xì)菌菌懸液離心（12 000 r/min）5min，倒出上清，并用磷酸鹽（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液清洗兩次，然后，利用紫外-可見吸收分光光度計(jì)600 nm波長調(diào)整到所需的濃度，另外，利用活菌計(jì)數(shù)法對其進(jìn)行計(jì)數(shù)。

用PBS緩沖液配制NH2-Fe3O4磁性顆粒懸濁液（10 mg/mL），不同體積NH2-Fe3O4磁性顆粒懸濁液加入到菌液中，渦旋振蕩，然后磁性分離，并用紫外－可見吸收分光光度計(jì)600 nm波長測量溶液OD值。

1.2.4 大腸桿菌O157：H7分析與鑒別

NH2-Fe3O4磁性顆粒吸附完畢，倒出上清后，加入50 μL氨水，在超聲清洗器中振蕩3min，磁性分離，去除NH2-Fe3O4磁性顆粒，上清12 000 r/min離心，然后分別加入10 μL 0.1%TFA與ACN后，渦旋振蕩，取1 μL溶液用于MALDI MS線性模式進(jìn)行分析。

利用 Flexanalysis軟件 （version 3.0；Bruker Dal tonics）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正、平滑和標(biāo)峰。然后利用 Tagident搜索工具（http：//web.expasy.org/tagident/）對質(zhì)譜峰進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索 （UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL）確定蛋白。然后，利用得到的核糖體蛋白搜索微生物快速鑒別數(shù)據(jù)庫（rapid microorganism identification database；http：//rmidb.org）確定大腸桿菌歸屬。

1.3 模擬實(shí)際樣本大腸桿菌O157：H7分析與鑒別

從超市中購買的碳酸飲料，加入活菌計(jì)數(shù)完畢的不同濃度的大腸桿菌O157：H7的菌懸液，然后利用NH2-Fe3O4磁性顆粒富集，MALDI MS檢測，并利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行菌株鑒別。

2 結(jié)果與分析

2.1 NH2-Fe3O4磁性顆粒表征

NH2-Fe3O4磁性顆粒合成完畢后，分別利用掃描電鏡、磁滯回線與紅外光譜對磁性顆粒的形貌、磁性能力與官能團(tuán)進(jìn)行分析見圖1。從電鏡圖上可以看出（圖1），NH2-Fe3O4磁性顆粒成球形，其直徑800 nm左右，其粒徑較大，為了便于超聲從菌體表面去除，以利于菌體檢測。另外，在磁滯回線圖上（圖2），其磁化值分別為50emu/g，這非常便于磁球從溶液中分離。同時(shí)，從紅外譜圖上（圖3），可以看到在620 cm-1和453 cm-1吸收峰對應(yīng)為Fe-O鍵的振動吸收和1 630 cm-1處NH的彎曲振動，由紅外光譜圖可知，NH2-Fe3O4磁性顆粒被成功合成。

圖1 NH2-Fe3O4顆粒掃描電鏡Fig.1 Scanning electron microscopy of NH2-Fe3O4particles

圖2 NH2-Fe3O4顆粒磁滯回線Fig.2 Hysteresis loop of NH2-Fe3O4particles

圖3 NH2-Fe3O4顆粒紅外譜圖Fig.3 Infrared spectrum of NH2-Fe3O4particles

2.2 NH2-Fe3O4磁性顆粒對大腸桿菌O157：H7的富集

圖4 NH2-Fe3O4磁性顆粒富集的優(yōu)化Fig.4 Enrichment optimization of NH2-Fe3O4magnetic particle

由于細(xì)菌PBS緩沖液條件下帶負(fù)電荷，而NH2-Fe3O4磁性顆粒的等電點(diǎn)為3，而使磁球帶正電荷，因此磁球會很快吸附到菌體表面，在外加磁場的作用下，菌體會脫離水溶液，而得到富集。磁球富集條件的優(yōu)化見圖4。

從圖4可以看出，當(dāng)富集時(shí)間到達(dá)70 s時(shí)，菌體幾乎100%得到富集。而磁球濃度為0.5 mg/mL時(shí)，磁球富集的效果最佳。因此，利用NH2-Fe3O4磁性顆粒富集大腸桿菌簡單、快速，而且合成的成本很低。

2.3 MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的檢測限

通過NH2-Fe3O4磁性顆粒富集，使MALDI/TOF MS對低濃度細(xì)菌進(jìn)行檢測，不同細(xì)菌濃度的質(zhì)譜圖見圖5，NH2-Fe3O4磁性顆粒富集效果的對比見圖6。

圖5 不同細(xì)菌濃度的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of different bacterial concentrations

圖6 NH2-Fe3O4磁性顆粒富集效果的對比Fig.6 Comparison of enrichment effects of NH2-Fe3O4magnetic particles

從圖5可以看出，通過對大腸桿菌O157：H7一系列的稀釋，富集后，當(dāng)細(xì)菌濃度為3.5×102CFU/mL時(shí)（圖5A），幾乎沒有質(zhì)譜信號，而當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到3.5×103CFU/mL時(shí)（圖5B），有清晰的質(zhì)譜信號，而主要的質(zhì)譜峰與細(xì)菌濃度在3.5×104CFU/mL時(shí)幾乎無異（圖5C），同時(shí)這些質(zhì)譜的信噪比超過5，因此MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的檢測限達(dá)到3.5×103CFU/mL。

另外，通過對比未富集的大腸桿菌O157：H7的質(zhì)譜圖可以看出（圖6），在細(xì)菌濃度為3.5×104CFU/mL時(shí)，未富集的質(zhì)譜在大于5 000 m/z以上，未有質(zhì)譜峰出現(xiàn)，而富集后，質(zhì)譜峰數(shù)量大大增加，因此，通過NH2-Fe3O4磁性顆粒的富集，可以大大提高M(jìn)ALDI/TOF MS的檢測能力。

2.4 模擬實(shí)際樣本中大腸桿菌MALDI/TOF MS檢測與鑒別

本文采用的模擬實(shí)際樣本為超市購買的碳酸飲料，通過添加不同濃度的大腸桿菌O157：H7，然后利用NH2-Fe3O4磁性顆粒富集及MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7進(jìn)行檢測，由于實(shí)際樣本中成分比較復(fù)雜，飲料中的陽離子會壓制質(zhì)譜信號，通過一系列不同菌濃的檢測，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌濃度在8×103CFU/mL得到的譜圖可以用于菌株的鑒別，細(xì)菌濃度在8×103CFU/mL，MAL DI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的質(zhì)譜圖見圖7。

圖7 MALDI/TOF MS對實(shí)際樣本中大腸桿菌O157：H7檢測Fig.7 Detection of Escherichia coli O157：H7 in real samples using MALDI/TOF MS

為了利用質(zhì)譜對大腸桿菌O157：H7進(jìn)行鑒別，對質(zhì)譜圖進(jìn)行處理包括基線校正、平滑，選取信噪比大于5的14個(gè)質(zhì)譜峰作為菌株鑒別的依據(jù)，這些質(zhì)譜峰通過搜索UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL的蛋白數(shù)據(jù)庫，最終確定14個(gè)質(zhì)譜峰蛋白歸屬，每個(gè)質(zhì)譜峰的蛋白搜索結(jié)果見表1。

表1 大腸桿菌O157：H7蛋白Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果Table 1 Search results of Escherichia coli O157：H7 protein in Swiss-Prot/TrEMBL database

這其中共有4個(gè)核糖體蛋白被發(fā)現(xiàn)，分別是核糖體大亞基的L32、L33、L34、L36 4種蛋白，由于核糖體蛋白具有保守性，通過輸入4種核糖體蛋白的質(zhì)譜峰，搜索核糖體蛋白數(shù)據(jù)庫可以對菌株進(jìn)行鑒別，其鑒別結(jié)果為大腸桿菌O157：H7。

3 結(jié)論

本文合成了NH2-Fe3O4磁性顆粒，并利用掃描電鏡、磁滯回線和紅外光譜對其進(jìn)行表征，表征結(jié)果證明NH2-Fe3O4磁性顆粒被成功合成，并具有很強(qiáng)的磁性。然后優(yōu)化了NH2-Fe3O4磁性顆粒富集大腸桿菌O157：H7富集條件。并通過富集，得到MALDI/TOF MS對大腸桿菌O157：H7的檢測限為3.5×103CFU/mL。最后，通過模擬實(shí)際樣本對該方法進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該方法對碳酸飲料中的大腸桿菌O157：H7的檢測限為8.0×104CFU/mL，并利用蛋白數(shù)據(jù)庫通過4種核糖體蛋白的搜索，證明該菌為大腸桿菌O157：H7。因此，試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明該方法簡單、快速、成本低，可以用于細(xì)菌的分析鑒別。

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