發(fā)酵型石榴枸杞酒的工藝優(yōu)化

李秀秀，吳昊，2，*，白美丹，董晨，李宗磊

（1.徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州221140；2.中國礦業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇徐州 221116）

隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，健康成為人們越來越關(guān)注的話題，保健酒具有預(yù)防疾病，增強(qiáng)人體免疫力等功效，愈來愈受人們的追捧。當(dāng)前保健酒生產(chǎn)工藝主要有浸泡、勾兌和發(fā)酵等方法，其中浸泡、勾兌都不能將原材料中的活性成分充分溶出，因而降低了保健功效，而且酒感差，不易于被消費(fèi)者接受。

本研究中旨在開發(fā)出新型石榴枸杞發(fā)酵保健酒，加入的酵母菌能夠充分利用果汁中的糖分生成酒精，并將石榴和枸杞中的營養(yǎng)成分溶出，充分汲取了兩者的活性有效成分，具有美容養(yǎng)顏、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力，預(yù)防心血管及腫瘤等保健功效[1-2]。本文重點(diǎn)探討了影響石榴枸杞酒的發(fā)酵工藝參數(shù)，確定最優(yōu)工藝條件，為石榴枸杞發(fā)酵酒的開發(fā)和生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

石榴：徐州賈汪；枸杞：寧夏；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；果膠酶（生化級）：江蘇銳陽生物科技有限公司；二氧化硫（食品級）：法國進(jìn)口；葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品）：中國計(jì)量科學(xué)研究院；沒食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品）、蘆?。?biāo)準(zhǔn)品）、綠原酸（標(biāo)準(zhǔn)品）：北京萬佳首化生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

料理機(jī)：九陽股份有限公司；DZG-6090真空電熱干燥箱、DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；WYT-J手持式糖度計(jì)：杭州生物科技有限；酒精計(jì)：河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠；FA1204B電子天平、UV1901PCS紫外可見分光光度計(jì)：上海儀器儀表有限公司；SHB循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA（廣州）儀器設(shè)備有限公司；GL-20B高速冷凍離心機(jī)：上?？茖W(xué)儀器廠；Essentia LC-15C高效液相色譜：SHIMADZU儀器（蘇州）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 石榴枸杞酒的工藝流程

1.3.2 石榴汁的制作

挑選個大、無損壞的石榴，去掉外皮和內(nèi)種皮，用清水清洗數(shù)次，按照石榴比水1∶1（g/mL）的比例加水，放入料理機(jī)進(jìn)行榨汁[3]。

1.3.3 枸杞汁的制作

挑選個大、果肉肥厚無霉變的枸杞果，用清水清洗數(shù)次，按照枸杞比水2.5∶1（g/mL）的比例加水，浸泡3 h，放入料理機(jī)進(jìn)行榨汁[3]。

1.3.4 成分調(diào)配

將兩種果汁按照一定比例混合200 mL放入發(fā)酵瓶中，用移液管吸取5 mL，在離心機(jī)3 600 r/min下離心10min之后，用移液管移取上清液并測量其糖度及酸度，按每17 g/L的糖能產(chǎn)生1%vol酒精調(diào)整糖度，本試驗(yàn)用白砂糖調(diào)整糖度，使糖度達(dá)到25%，用檸檬酸調(diào)pH值在3.1～3.8之間即可[4-5]。

1.3.5 混合原料預(yù)處理

將成分調(diào)配好的果汁混合液，放入一定量的果膠酶和 SO2，接入活化酵母[6-9]。

1.3.6 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

考察石榴枸杞汁比、酵母量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間等4個因素對酒精度的影響，探討單因素的最佳工藝參數(shù)。

1.3.7 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選擇了石榴枸杞汁比、酵母量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間4個因素3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)[10-13]。試驗(yàn)因素水平見下表1。

表1 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process

1.3.8 感官評定

發(fā)酵結(jié)束，挑選了10名有經(jīng)驗(yàn)的釀酒師進(jìn)行品嘗，打分取其平均值。石榴枸杞保健酒的感官評定標(biāo)準(zhǔn)包括酒體、口感、色澤3項(xiàng)，總分100分[14-16]。保健酒的評分依據(jù)見表2。

表2 酒的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory organ criteria for evaluation of health wine

1.3.9綜合評價

發(fā)酵酒的質(zhì)量主要以酒精度和感官評定為評判標(biāo)準(zhǔn)，因此本試驗(yàn)以酒精度和感官評定各50%的權(quán)重為綜合評判。綜合評價=酒精度×50%+感官評定×50%。

1.3.10 后發(fā)酵處理

前發(fā)酵結(jié)束后，將上部清液轉(zhuǎn)入另一個已滅過菌的發(fā)酵瓶中，與酵母及酒腳等沉淀物分離，在16℃～20℃下發(fā)酵30 d。

1.3.11 發(fā)酵酒多酚類化合物的含量測定

因石榴中含有多種多酚類活性物質(zhì)，是保健酒中重要的活性成分，因此檢測分析發(fā)酵酒中的多酚類化合物含量可作為保健酒質(zhì)量的評判標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)選擇沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu比色法進(jìn)行測定[17-18]。

1.3.12 發(fā)酵酒多糖的含量測定

枸杞含有枸杞多糖的活性成分，具有抗氧化作用，增強(qiáng)人體免疫力。因此，對發(fā)酵酒中多糖含量的檢測和分析，可作為保健酒質(zhì)量的評價標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)選擇以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品，用硫酸-苯酚比色法進(jìn)行測定[19]。

1.3.13 發(fā)酵酒黃酮的含量測定

用亞硝酸鈉和硝酸鋁絡(luò)合法測定發(fā)酵酒中的黃酮含量[20]。

1.3.14 發(fā)酵酒綠原酸的含量測定

發(fā)酵酒綠原酸含量測定采用高效液相色譜法見文獻(xiàn)[21]。

1.3.15 發(fā)酵酒質(zhì)量指標(biāo)分析

按GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定酒精度、總糖、總酸和干浸出物含量。按GB 2758-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》測定細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群數(shù)以及致病菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴枸杞汁比對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響

取經(jīng)處理好的石榴枸杞汁，在酵母量4%，發(fā)酵溫度26℃，發(fā)酵時間6 d的條件下，考察不同石榴枸杞汁比對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響，見圖1。

圖1 石榴枸杞汁比對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響Fig.1 Influence of juice ration on pomegranateandmedlar fermentation wine

由圖1可知，當(dāng)石榴枸杞汁體積比為2∶1時酒精度達(dá)到最高，可能是因?yàn)榇藭r的石榴枸杞混合汁的滲透壓較適合釀酒酵母的生長，因此酵母代謝產(chǎn)生酒精含量高[22]。當(dāng)逐漸增加石榴汁的比例時，由于石榴汁相比較枸杞汁來說含糖量較低，因此補(bǔ)加的白砂糖愈多，可能對發(fā)酵過程產(chǎn)生消極的影響，當(dāng)二者體積比超過2∶1時酒精度呈下降趨向，這可能與添加白砂糖可能會影響到酵母的正常生長和代謝有關(guān)。因此，選擇石榴枸杞汁體積比2∶1為最佳汁液比。

2.2 酵母量對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響

取經(jīng)處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁體積比為2∶1，發(fā)酵溫度26℃，發(fā)酵時間6 d的條件下，考察不同酵母量對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響，見圖2。

圖2 酵母量對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響Fig.2 Influence of yeast addition quantity on pomegranate and medlar fermentation wine

由圖2可知，隨酵母量的增加酒精度增加，糖度則相應(yīng)的減少，因?yàn)榻湍噶吭蕉?，越有利于糖向酒精產(chǎn)物方向轉(zhuǎn)化，但當(dāng)酵母量超過3%時，酒精度反而減小，可能是因?yàn)榻湍噶窟^多，導(dǎo)致微生物繁殖過快而造成底物營養(yǎng)缺乏，微生物產(chǎn)生激烈的競爭，從而影響微生物生長發(fā)酵[23]。酵母量超過3%時，由于營養(yǎng)源不足造成發(fā)酵酒中的含糖量略微增加，因此選擇酵母接種量為3%時為最佳添加量。

2.3 發(fā)酵溫度對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響

取經(jīng)處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量4%，發(fā)酵時間6 d的條件下，考察不同發(fā)酵溫度對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響，見圖3。

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高酒精度不斷增加，當(dāng)溫度到達(dá)26℃時酒精度達(dá)到最大值，糖度為最小值，溫度超過26℃酒精度呈下降趨向，因?yàn)闇囟葘湍妇纳L繁殖有重要的影響，溫度低于26℃，此時沒有達(dá)到酵母菌的最適生長溫度，酵母菌生長繁殖較慢，隨著溫度的升高，酵母菌成長速度逐步加快，26℃時生長繁殖最快，新陳代謝旺盛，產(chǎn)酒精量高。當(dāng)溫度超過26℃時，此時影響了酵母菌的生產(chǎn)繁殖，代謝降低，酒精度降低，所以選擇溫度26℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖3 發(fā)酵溫度對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響Fig.3 Influence of temperature on pomegranate and medlar fermentation wine

2.4 發(fā)酵時間對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響

取經(jīng)處理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量4%，發(fā)酵溫度26℃的條件下，考察不同發(fā)酵時間對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響，見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對石榴枸杞發(fā)酵酒的影響Fig.4 Influence of time on pomegranate and medlar fermentation wine

由圖4可知，在發(fā)酵3 d～6 d酒精度呈平緩上升，第6天酒精度達(dá)到最高，6天之后呈下降趨勢，剛開始隨著發(fā)酵時間不斷增加，酵母菌不斷適應(yīng)新的生長環(huán)境，經(jīng)歷遲滯生長期，糖醇轉(zhuǎn)化率也在不斷提高，第6天的時候酵母菌的發(fā)酵趨于穩(wěn)定，酒精度為最高，隨后進(jìn)入后熟階段。在后熟階段，可能有部分糖轉(zhuǎn)變成其他的小分子代謝產(chǎn)物，所以糖含量呈略微下降趨勢。選擇發(fā)酵時間6 d為最佳發(fā)酵時間。

2.5 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

以發(fā)酵酒酒精度為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

由表3可知，發(fā)酵的最大影響因素是發(fā)酵溫度，其次依次是酵母量、石榴枸杞汁比、發(fā)酵時間。發(fā)酵最佳工藝組合為A2B2C3D2，即石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量為3%，溫度為28℃，時間為6 d。

由表4可知，對發(fā)酵酒的影響差異極顯著的因素是發(fā)酵溫度（p＜0.01），差異顯著的是酵母接種量因素（p＜0.05）。在最佳工藝條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，酒精度為11.5%，評分達(dá)到 94.4，見表5。

表3 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Analysis and results of orthogonal experiments for fermentation processes optimization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance of orthogonal experiments results and analysis

表5 最佳發(fā)酵工藝試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Test results of the optimized fermentation process

2.6 發(fā)酵酒活性成分含量檢測

在最優(yōu)工藝條件下獲得的發(fā)酵酒，經(jīng)陳釀澄清過濾取樣分析，每項(xiàng)測定取3個平行樣進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見表6。

表6 石榴枸杞酒活性成分含量檢測結(jié)果Table 6 Test results of content of active component on pomegranate and medlar wine

由表6可以看出，發(fā)酵酒中含多酚、多糖、黃酮以及綠原酸含量分別為200 mg/L、1.15 g/L、56.14 mg/L、35.15 mg/L，這些有效成分對心血管疾病的防治具有一定的療效[18]。

2.7 發(fā)酵酒的質(zhì)量指標(biāo)

2.7.1 理化指標(biāo)

酒度：11.5%Vol；總糖（葡萄糖計(jì)）：17.23 g/L；總酸（檸檬酸計(jì)）：5.34 g/L；干浸出物：31.32 g/L。

2.7.2 微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤50cfu/mL；大腸菌群數(shù)≤3MPN/100mL；致病菌數(shù)=0。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出石榴枸杞的最佳發(fā)酵工藝條件即石榴枸杞汁體積比為2∶1，酵母量為3%，溫度為28℃，時間為6 d，由此得到的保健酒香純厚，酒味突出，顏色為棕紅色，有光澤，透明度高，無苦澀味。發(fā)酵酒經(jīng)過陳釀澄清得到成品酒，經(jīng)檢測，產(chǎn)品符合GB 2758-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》，酒體中含有豐富的活性物質(zhì)，其中多酚類化合物含量200 mg/L，多糖含量達(dá)1.15 g/L，具有防治心血管疾病及增強(qiáng)人體免疫能力等保健功效。

本試驗(yàn)采用石榴枸杞混合發(fā)酵釀制保健酒，充分利用了石榴枸杞的營養(yǎng)價值以及保健作用，對今后保健酒的制備有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

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