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    響應(yīng)面法優(yōu)化女貞子多酚提取工藝條件及其抑菌活性研究

    2018-06-05 06:57:08
    食品研究與開發(fā) 2018年11期
    關(guān)鍵詞:研究

    (吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林132013)

    女貞子(Ligustrum lucidum Ait)是木犀科植物女貞(Privet)的干燥成熟果實,具有良好的生物活性,如抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、抗肝炎、抗菌、提高機體免疫力等作用[1-2]?!侗静輳男隆分杏涊d:“女貞子甘苦涼,少陰之精,隆冬不凋。益肝腎,安五臟,強腰膝,明耳目,烏須發(fā)。補風(fēng)虛,除百病”[3]。女貞子常用于臨床治療肝腎虛弱、腰膝酸軟等癥[4]。通過對女貞子成分的鑒定后發(fā)現(xiàn),女貞子中含有紅色素屬花青素成分,是存在于女貞子中的一種植物多酚,易溶于極性溶劑,對光、熱和鹽的穩(wěn)定性好[5]。植物多酚是植物中廣泛存在的一種芳香族羥基衍生物的總稱,具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種功能[6-7],因而植物多酚的提取,能為其后續(xù)深加工技術(shù)的發(fā)展提供前期基礎(chǔ)[8]。目前關(guān)于女貞子多酚提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化及抗菌研究相對較少。本試驗通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化女貞子多酚的提取工藝,以期完善女貞子多酚提取的基礎(chǔ)研究,在此基礎(chǔ)上進一步研究女貞子多酚的抗菌活性,為女貞子深加工技術(shù)研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    女貞子(產(chǎn)地:河北):吉林市雙翔大藥房;福林-酚試劑:索萊寶公司;沒食子酸:sigma公司;碳酸鈉、無水乙醇(均為化學(xué)純):北京化工廠;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌:吉林醫(yī)藥學(xué)院細(xì)胞生物教研室贈送。

    1.2 儀器與設(shè)備

    KQ-800KDE高功率超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;5810R低速離心機:艾本德公司;722型分光光度計:上海菁華科技有限公司;N-1300V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:東京理化器械株式會社;CN-500A多功能粉碎機:中南制藥機械廠;202-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:天津泰森儀器股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 女貞子前處理及提取

    女貞子粉碎后過60目篩,烘干至恒重,分別稱取2.0 g女貞子粉末置于錐形瓶中,加入適量的提取劑,封住瓶口,在不同超聲波條件下提取,3 000 r/min離心10min,取上清液過濾,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行濃縮水化處理,定容,即為女貞子總多酚提取液。

    1.3.2 女貞子多酚含量的測定

    采用福林-酚法[9]檢測提取物中多酚含量:移液槍取上清液 2 mL,加 5.8 mL 蒸餾水,0.5 mL 福林-酚試劑,混勻,5min 后,加入 2.5 mL 10%Na2CO3溶液,混勻后定容。40℃條件下避光反應(yīng)1 h,在760 nm波長下測定吸光度值。以沒食子酸為為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸線性方程 y=0.011+5.147x(R2=0.999 1),沒食子酸在 0.01 mg/mL~0.11 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出女貞子提取液多酚的質(zhì)量濃度。

    1.3.3 女貞子總多酚提取率

    式中:X為樣品中的多酚提取率(女貞子中含有相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)),%;ρ為提取液樣品中的多酚質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液定容后的體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量,mg。

    1.3.4 女貞子多酚提取工藝優(yōu)化

    1.3.4.1 單因素試驗

    為研究不同提取因素對女貞子多酚提取率的影響,選取對多酚提取影響較大的4個條件進行研究,單因素試驗設(shè)計如表1所示,固定提取條件為:液料比60 ∶1(mL/g)、提取時間 50min、提取功率 480 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。

    表1 單因素試驗設(shè)計Table 1 Design of factors and levels of single test

    1.3.4.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behenken試驗設(shè)計原理,以女貞子多酚提取率為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面法進行四因素三水平的試驗設(shè)計,優(yōu)化超聲波輔助提取女貞子多酚工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析表如表2所示。

    表2 響應(yīng)面因素水平設(shè)計Table 2 Design of factors and levels of response surface test

    1.3.5 女貞子多酚的抑菌試驗

    1.3.5.1 菌懸液的制備

    將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌分別接種于肉湯(Luria-Bertani,LB)培養(yǎng)基,37℃下恒溫培養(yǎng)24 h,連續(xù)活化培養(yǎng)2次,根據(jù)試驗需要用無菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度。

    1.3.5.2 試管二倍梯度稀釋法測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)

    在無菌條件下,取13支試管編號,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌分別進行研究。從2號管開始,每管加入3 mL雙蒸水,1號管加入600 μg/mL女貞子多酚提取液6 mL,吸取3 mL多酚提取液到下一管中并混勻,依次稀釋,11號管吸取3 mL溶液并棄掉。每管加入LB培養(yǎng)基3 mL,接種0.3 mL菌液,并混勻。以3.3 mL雙蒸水加3 mL LB液體培養(yǎng)基為陰性對照,以3 mL無菌去離子水加3 mL的LB液體培養(yǎng)基接種0.3 mL菌液為陽性對照,將處理好的樣品放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,在600 nm處測定各樣品吸光度值,當(dāng)樣品吸光度值接近陰性對照時,該管的多酚濃度即為MIC[10]。每個樣品重復(fù)3次試驗,測量結(jié)果取平均值。

    1.3.5.3 濾紙片法測定女貞子多酚的抑菌作用

    用打孔器制直徑6 mm濾紙片若干,放入干燥培養(yǎng)皿中滅菌,干燥備用。制備固體LB培養(yǎng)基,加入0.2 mL菌懸液并涂布均勻。用鑷子取干燥濾紙片分別蘸取女貞子多酚提取液、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液和雙蒸水,放入涂布后的平板上,浸泡乙醇溶液的濾紙片為陽性對照,浸泡雙蒸水的濾紙片為陰性對照[11-12]。培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。每個樣品重復(fù)3次試驗,測量結(jié)果取平均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    液料比、提取時間、提取功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對女貞子多酚提取率的影響見圖1。

    由圖1A 可知,液料比為20 ∶1(mL/g)~60 ∶1(mL/g)時,隨著溶劑用量的增加,多酚提取率顯著增加。液料比為60∶1(mL/g)時,女貞子多酚基本溶出完全,增大液料比會導(dǎo)致多糖等物質(zhì)溶出,但不能增加多酚提取率[13]。女貞子多酚的液料比控制在60∶1(mL/g)左右為宜。

    由圖1B可知,隨著提取時間從10min增加至50min,多酚提取率隨細(xì)胞酶解程度增加而不斷增加。當(dāng)超聲提取時間延長至70min以后,多糖等其他物質(zhì)溶出,提取的多酚會隨著提取時間的延長而逐漸降解。女貞子多酚的提取時間控制在50min左右為宜。

    由圖1C可知,超聲功率在160 W~640 W范圍內(nèi),女貞子多酚提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,640 W時,多酚提取率達到最大,這可能與超聲波產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”有關(guān)。樣品超聲時可使媒介粒子的速度和加速度增大,導(dǎo)致界面擴散層上的分子擴散加快,最終使多酚的溶出速度加快。當(dāng)超聲波功率超過640 W后,過高的“空化效應(yīng)”會使女貞子多酚的結(jié)構(gòu)遭到破壞,同時雜質(zhì)溶出增加,導(dǎo)致女貞子多酚提取率下降[14]。因此,女貞子多酚的提取功率控制在640 W左右為宜。

    由圖1D可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%~50%時,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,多酚提取率逐漸增加。乙醇體積分?jǐn)?shù)達到50%時,多酚的提取率達到最大。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%~70%時,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,溶液的極性不斷增強,多酚的溶解度逐漸下降[14],導(dǎo)致多酚的提取率也逐漸降低。因此,提取女貞子多酚時,乙醇的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在50%左右為宜。

    2.2 Box-Behnken 試驗設(shè)計與結(jié)果

    利用 Design-Expert 8.0.6 軟件進行數(shù)據(jù)擬合,試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

    表3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and data from the Box-Behnken test

    續(xù)表3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Continue table 3 Design and data from the Box-Behnken test

    2.3 模型的建立與顯著性檢驗

    利用 Design-Expert V8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得多元回歸方程:

    Y=6.00+0.34A+0.23B+0.12C+0.022D -0.23AB+0.22AC-0.067AD-0.49BC-0.38BD+0.18CD-0.25A2-0.27B2-0.40C2-0.25D2,方差分析顯著性檢驗結(jié)果如表4所示。

    表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

    由表4可知,方程模型的顯著性P<0.000 1屬極顯著范圍,說明該模型是有效可靠的。本次模型的失擬項 P 值為0.671 8>0.05,不顯著,說明此模型的擬合度良好。提取時間(A)和提取功率(B)對女貞子多酚提取率的影響極顯著;二次項提取功率-液料比(BC)、提取功率-乙醇體積分?jǐn)?shù)(BD)以及 A2、B2、C2、D2亦為極顯著,提取時間-提取功率(AB)和提取時間-料液比(AC)的影響為顯著。R2=0.928 4,說明該模型能解釋92.84%響應(yīng)值的變化,R2Adj=0.856 8,說明可信度較好,可以運用該模型分析女貞子中多酚提取率。

    圖2 各因素交互作用對多酚提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 The effect of various factors and interaction on the extration ratio of polyphenols

    2.4 響應(yīng)面分析

    各因素交互作用對多酚提取率影響的響應(yīng)曲面圖見圖2。

    響應(yīng)面圖能夠形象描述回歸方程,直觀反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系與交互作用,從而進一步優(yōu)化多酚提取條件。由圖2a可知,當(dāng)提取功率的水平為-1時,隨著提取時間的延長,多酚的提取率先上升后趨于平穩(wěn),當(dāng)提取功率的水平為0時,隨著提取時間的延長,多酚的提取率先上升后下降。提取功率的變化曲面與提取時間的變化曲面均陡峭,說明提取功率與提取時間對女貞子多酚的提取率影響均較顯著,與方差分析結(jié)果相符;由圖2b、圖2f可知,當(dāng)液料比一定時,女貞子多酚的提取率隨提取時間或乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)提取時間或乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時,女貞子多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。圖2c、圖2d、圖2e與圖2a類似,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)或液料比的水平為-1時,隨著提取時間或提取功率的增加,女貞子多酚的提取率不斷增加后逐漸趨于穩(wěn)定,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)或液料比的水平為0時,隨著提取時間或提取功率的增加女貞子多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

    由 Design-Expert 8.0.6 軟件得出的女貞子多酚的最優(yōu)提取工藝為:提取時間69.60min、提取功率480 W、液料比 80 ∶1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù) 59.21%。在此條件下模型預(yù)測的最大提取率為6.527%。在此條件下重復(fù)3次驗證試驗,所得多酚提取率平均值為6.553%,與理論值6.527%非常接近,說明該模型能較好地預(yù)測實際提取率。

    2.5 女貞子多酚MIC測定

    MIC的測定結(jié)果見表5。

    表5 MIC的測定結(jié)果Table 5 The results of MIC test

    由表5可知,女貞子多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度依次為600、300、150 μg/mL。可見女貞子多酚對3種供試菌的抑菌效果依次為:枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。

    2.6 濾紙片法測定女貞子多酚的抑菌作用

    多酚抑菌活性結(jié)果見表6。

    表6 多酚抑菌活性結(jié)果Table 6 The results of bacteriostasis of polyphenols

    從表6可以看出,女貞子多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌直徑分別為7.565、7.639、8.196 mm,600 μg/mL 女貞子多酚提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果均強于75%乙醇溶液。

    3 結(jié)論

    在超聲波輔助提取女貞子多酚單因素試驗基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取條件為:提取時間69.60min、提取功率 480 W、液料比 80 ∶1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)59.21%。在此條件下女貞子多酚提取率為6.527%,與預(yù)測值相符,該方法提取女貞子多酚是準(zhǔn)確可行的。通過對提取的多酚物質(zhì)活性鑒定后發(fā)現(xiàn),其能有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的增殖,該研究為女貞子活性成分的深度開發(fā)提供了理論依據(jù)。

    [1]孫雅文,張明發(fā),沈雅琴.女貞子及其活性成分降血糖、調(diào)血脂、抗肥胖作用研究進展[J].藥物評價研究,2016,39(6):1086-1091

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