響應(yīng)面法優(yōu)化女貞子多酚提取工藝條件及其抑菌活性研究

（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林132013）

女貞子（Ligustrum lucidum Ait）是木犀科植物女貞（Privet）的干燥成熟果實(shí)，具有良好的生物活性，如抗骨質(zhì)疏松、抗衰老、抗肝炎、抗菌、提高機(jī)體免疫力等作用[1－2]。《本草從新》中記載：“女貞子甘苦涼，少陰之精，隆冬不凋。益肝腎，安五臟，強(qiáng)腰膝，明耳目，烏須發(fā)。補(bǔ)風(fēng)虛，除百病”[3]。女貞子常用于臨床治療肝腎虛弱、腰膝酸軟等癥[4]。通過對女貞子成分的鑒定后發(fā)現(xiàn)，女貞子中含有紅色素屬花青素成分，是存在于女貞子中的一種植物多酚，易溶于極性溶劑，對光、熱和鹽的穩(wěn)定性好[5]。植物多酚是植物中廣泛存在的一種芳香族羥基衍生物的總稱，具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種功能[6－7]，因而植物多酚的提取，能為其后續(xù)深加工技術(shù)的發(fā)展提供前期基礎(chǔ)[8]。目前關(guān)于女貞子多酚提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化及抗菌研究相對較少。本試驗(yàn)通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化女貞子多酚的提取工藝，以期完善女貞子多酚提取的基礎(chǔ)研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究女貞子多酚的抗菌活性，為女貞子深加工技術(shù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

女貞子（產(chǎn)地：河北）：吉林市雙翔大藥房；福林－酚試劑：索萊寶公司；沒食子酸：sigma公司；碳酸鈉、無水乙醇（均為化學(xué)純）：北京化工廠；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌：吉林醫(yī)藥學(xué)院細(xì)胞生物教研室贈送。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ－800KDE高功率超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；5810R低速離心機(jī)：艾本德公司；722型分光光度計：上海菁華科技有限公司；N－1300V－WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社；CN－500A多功能粉碎機(jī)：中南制藥機(jī)械廠；202－1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津泰森儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 女貞子前處理及提取

女貞子粉碎后過60目篩，烘干至恒重，分別稱取2.0 g女貞子粉末置于錐形瓶中，加入適量的提取劑，封住瓶口，在不同超聲波條件下提取，3 000 r/min離心10min，取上清液過濾，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮水化處理，定容，即為女貞子總多酚提取液。

1.3.2 女貞子多酚含量的測定

采用福林－酚法[9]檢測提取物中多酚含量：移液槍取上清液 2 mL，加 5.8 mL 蒸餾水，0.5 mL 福林－酚試劑，混勻，5min 后，加入 2.5 mL 10%Na2CO3溶液，混勻后定容。40℃條件下避光反應(yīng)1 h，在760 nm波長下測定吸光度值。以沒食子酸為為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸線性方程 y=0.011+5.147x（R2=0.999 1），沒食子酸在 0.01 mg/mL～0.11 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出女貞子提取液多酚的質(zhì)量濃度。

1.3.3 女貞子總多酚提取率

式中：X為樣品中的多酚提取率（女貞子中含有相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)），%；ρ為提取液樣品中的多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液定容后的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 女貞子多酚提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

為研究不同提取因素對女貞子多酚提取率的影響，選取對多酚提取影響較大的4個條件進(jìn)行研究，單因素試驗(yàn)設(shè)計如表1所示，固定提取條件為：液料比60 ∶1（mL/g）、提取時間 50min、提取功率 480 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計Table 1 Design of factors and levels of single test

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behenken試驗(yàn)設(shè)計原理，以女貞子多酚提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面法進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計，優(yōu)化超聲波輔助提取女貞子多酚工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析表如表2所示。

表2 響應(yīng)面因素水平設(shè)計Table 2 Design of factors and levels of response surface test

1.3.5 女貞子多酚的抑菌試驗(yàn)

1.3.5.1 菌懸液的制備

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌分別接種于肉湯（Luria－Bertani，LB）培養(yǎng)基，37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)2次，根據(jù)試驗(yàn)需要用無菌生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度。

1.3.5.2 試管二倍梯度稀釋法測定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）

在無菌條件下，取13支試管編號，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌分別進(jìn)行研究。從2號管開始，每管加入3 mL雙蒸水，1號管加入600 μg/mL女貞子多酚提取液6 mL，吸取3 mL多酚提取液到下一管中并混勻，依次稀釋，11號管吸取3 mL溶液并棄掉。每管加入LB培養(yǎng)基3 mL，接種0.3 mL菌液，并混勻。以3.3 mL雙蒸水加3 mL LB液體培養(yǎng)基為陰性對照，以3 mL無菌去離子水加3 mL的LB液體培養(yǎng)基接種0.3 mL菌液為陽性對照，將處理好的樣品放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在600 nm處測定各樣品吸光度值，當(dāng)樣品吸光度值接近陰性對照時，該管的多酚濃度即為MIC[10]。每個樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，測量結(jié)果取平均值。

1.3.5.3 濾紙片法測定女貞子多酚的抑菌作用

用打孔器制直徑6 mm濾紙片若干，放入干燥培養(yǎng)皿中滅菌，干燥備用。制備固體LB培養(yǎng)基，加入0.2 mL菌懸液并涂布均勻。用鑷子取干燥濾紙片分別蘸取女貞子多酚提取液、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液和雙蒸水，放入涂布后的平板上，浸泡乙醇溶液的濾紙片為陽性對照，浸泡雙蒸水的濾紙片為陰性對照[11－12]。培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。每個樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，測量結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

液料比、提取時間、提取功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對女貞子多酚提取率的影響見圖1。

由圖1A 可知，液料比為20 ∶1（mL/g）～60 ∶1（mL/g）時，隨著溶劑用量的增加，多酚提取率顯著增加。液料比為60∶1（mL/g）時，女貞子多酚基本溶出完全，增大液料比會導(dǎo)致多糖等物質(zhì)溶出，但不能增加多酚提取率[13]。女貞子多酚的液料比控制在60∶1（mL/g）左右為宜。

由圖1B可知，隨著提取時間從10min增加至50min，多酚提取率隨細(xì)胞酶解程度增加而不斷增加。當(dāng)超聲提取時間延長至70min以后，多糖等其他物質(zhì)溶出，提取的多酚會隨著提取時間的延長而逐漸降解。女貞子多酚的提取時間控制在50min左右為宜。

由圖1C可知，超聲功率在160 W～640 W范圍內(nèi)，女貞子多酚提取率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，640 W時，多酚提取率達(dá)到最大，這可能與超聲波產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”有關(guān)。樣品超聲時可使媒介粒子的速度和加速度增大，導(dǎo)致界面擴(kuò)散層上的分子擴(kuò)散加快，最終使多酚的溶出速度加快。當(dāng)超聲波功率超過640 W后，過高的“空化效應(yīng)”會使女貞子多酚的結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時雜質(zhì)溶出增加，導(dǎo)致女貞子多酚提取率下降[14]。因此，女貞子多酚的提取功率控制在640 W左右為宜。

由圖1D可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～50%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚提取率逐漸增加。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時，多酚的提取率達(dá)到最大。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，溶液的極性不斷增強(qiáng)，多酚的溶解度逐漸下降[14]，導(dǎo)致多酚的提取率也逐漸降低。因此，提取女貞子多酚時，乙醇的體積分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在50%左右為宜。

2.2 Box－Behnken 試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

利用 Design－Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and data from the Box-Behnken test

續(xù)表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Continue table 3 Design and data from the Box-Behnken test

2.3 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用 Design－Expert V8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得多元回歸方程：

Y=6.00+0.34A+0.23B+0.12C+0.022D －0.23AB+0.22AC－0.067AD－0.49BC－0.38BD+0.18CD－0.25A2－0.27B2－0.40C2－0.25D2，方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表4可知，方程模型的顯著性P＜0.000 1屬極顯著范圍，說明該模型是有效可靠的。本次模型的失擬項(xiàng) P 值為0.671 8＞0.05，不顯著，說明此模型的擬合度良好。提取時間（A）和提取功率（B）對女貞子多酚提取率的影響極顯著；二次項(xiàng)提取功率－液料比（BC）、提取功率－乙醇體積分?jǐn)?shù)（BD）以及 A2、B2、C2、D2亦為極顯著，提取時間－提取功率（AB）和提取時間－料液比（AC）的影響為顯著。R2=0.928 4，說明該模型能解釋92.84%響應(yīng)值的變化，R2Adj=0.856 8，說明可信度較好，可以運(yùn)用該模型分析女貞子中多酚提取率。

圖2 各因素交互作用對多酚提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 The effect of various factors and interaction on the extration ratio of polyphenols

2.4 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對多酚提取率影響的響應(yīng)曲面圖見圖2。

響應(yīng)面圖能夠形象描述回歸方程，直觀反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系與交互作用，從而進(jìn)一步優(yōu)化多酚提取條件。由圖2a可知，當(dāng)提取功率的水平為－1時，隨著提取時間的延長，多酚的提取率先上升后趨于平穩(wěn)，當(dāng)提取功率的水平為0時，隨著提取時間的延長，多酚的提取率先上升后下降。提取功率的變化曲面與提取時間的變化曲面均陡峭，說明提取功率與提取時間對女貞子多酚的提取率影響均較顯著，與方差分析結(jié)果相符；由圖2b、圖2f可知，當(dāng)液料比一定時，女貞子多酚的提取率隨提取時間或乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)提取時間或乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，女貞子多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。圖2c、圖2d、圖2e與圖2a類似，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)或液料比的水平為－1時，隨著提取時間或提取功率的增加，女貞子多酚的提取率不斷增加后逐漸趨于穩(wěn)定，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)或液料比的水平為0時，隨著提取時間或提取功率的增加女貞子多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

由 Design－Expert 8.0.6 軟件得出的女貞子多酚的最優(yōu)提取工藝為：提取時間69.60min、提取功率480 W、液料比 80 ∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù) 59.21%。在此條件下模型預(yù)測的最大提取率為6.527%。在此條件下重復(fù)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，所得多酚提取率平均值為6.553%，與理論值6.527%非常接近，說明該模型能較好地預(yù)測實(shí)際提取率。

2.5 女貞子多酚MIC測定

MIC的測定結(jié)果見表5。

表5 MIC的測定結(jié)果Table 5 The results of MIC test

由表5可知，女貞子多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度依次為600、300、150 μg/mL。可見女貞子多酚對3種供試菌的抑菌效果依次為：枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

2.6 濾紙片法測定女貞子多酚的抑菌作用

多酚抑菌活性結(jié)果見表6。

表6 多酚抑菌活性結(jié)果Table 6 The results of bacteriostasis of polyphenols

從表6可以看出，女貞子多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌直徑分別為7.565、7.639、8.196 mm，600 μg/mL 女貞子多酚提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌效果均強(qiáng)于75%乙醇溶液。

3 結(jié)論

在超聲波輔助提取女貞子多酚單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取條件為：提取時間69.60min、提取功率 480 W、液料比 80 ∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)59.21%。在此條件下女貞子多酚提取率為6.527%，與預(yù)測值相符，該方法提取女貞子多酚是準(zhǔn)確可行的。通過對提取的多酚物質(zhì)活性鑒定后發(fā)現(xiàn)，其能有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的增殖，該研究為女貞子活性成分的深度開發(fā)提供了理論依據(jù)。

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