基于響應(yīng)面法的微波輔助酶法提取核桃樹(shù)葉單寧

（焦作職工醫(yī)學(xué)院，河南焦作454000）

單寧作為一種廣泛分布于植物中的多酚羥基結(jié)構(gòu)化合物，水溶性好，不僅可與金屬離子發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的螯合物，同時(shí)還能與蛋白質(zhì)、多糖、生物堿等發(fā)生反應(yīng)[1]。單寧作為一種較高功能價(jià)值的植物提取物，在預(yù)防與治療自由基所引起的疾病、抑制脂質(zhì)、抗艾滋病等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性[2]，尤其是其所具有的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抑菌性等功能使其成為研究的熱點(diǎn)[3]。廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品保健等多個(gè)領(lǐng)域。

目前，國(guó)內(nèi)外單寧的生產(chǎn)多采用有水提取法、溶劑提取法、超臨界流體萃取法等[4]。不僅提取時(shí)間長(zhǎng)，單寧的生物活性也難以保證，抗氧化性能較弱。生物酶解技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型提取方法，通過(guò)生物酶破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使胞內(nèi)物質(zhì)更易溶解、擴(kuò)散，進(jìn)而達(dá)到有效提取的目的，具有條件溫和、提取物生物活性高等優(yōu)點(diǎn)[5]。同時(shí)，微波輻射有機(jī)物提取技術(shù)，通過(guò)將能量快速傳遞，可加速細(xì)胞內(nèi)有效成分的快速溶出，提高其反應(yīng)活性[6]，從而提高酶解得率。近年來(lái)，生物降解與微波輻射技術(shù)由于符合“環(huán)保、綠色”要求而發(fā)展迅速。而響應(yīng)面試驗(yàn)方法（response surface methodology，RSM）則可對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行有效優(yōu)化[7]，獲取最佳工藝。

本研究基于“綠色化學(xué)”的基本原則，以資源豐富的核桃樹(shù)葉為原料，采用微波輔助纖維素酶法提取核桃樹(shù)葉單寧。并通過(guò)RSM對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬提高得率，同時(shí)對(duì)所提取單寧的抗氧化性進(jìn)行探討。為從樹(shù)葉中提取單寧、并確保單寧的活性提供一種切實(shí)可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

核桃（Juglans regia L.）樹(shù)葉：采自山西省呂梁；纖維素酶（2×104U/mL）：諾維信生物技術(shù)有限公司（中國(guó)）；乙酸鋅、乙醇、乙二胺四乙酸、鉻黑T等試劑均為分析純。

FH102微型植物試樣粉碎機(jī)：湖北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠(chǎng)；MKX-H1C1B常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站：青島邁可威微波創(chuàng)新科技有限公司；SHY-2A水浴恒溫振蕩器：常州金壇市開(kāi)發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

1.2 提取方法與檢測(cè)

1.2.1 原料預(yù)處理

用蒸餾水將核桃樹(shù)葉洗凈后放入鼓風(fēng)干燥箱，在70℃溫度下烘干至恒重，再用微型植物試樣粉碎機(jī)破碎至50目。取粉末3.0 g，按1∶12的料液質(zhì)量比配置后置于常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站，在設(shè)定的微波功率下處理一定時(shí)間后冷卻至40℃，得到預(yù)處理液。

1.2.2 單寧的提取

加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶于預(yù)處理液中，然后加入200 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值后放入常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站中，在一定的工藝條件下進(jìn)行酶解后再提取一段時(shí)間，再冰浴冷卻至室溫，然后經(jīng)減壓、抽濾、干燥、粉碎得到核桃樹(shù)葉單寧粗提物。同時(shí)，采取無(wú)微波輔助的條件下進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

1.2.3 單寧含量測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[8]中所提供的方法、采用乙酸鋅絡(luò)合滴定法測(cè)定單寧的含量。

式中：m1為純化樣品中單寧的量，mg；m2為絕干核桃樹(shù)葉總質(zhì)量，mg。

1.2.4 清除自由基能力檢測(cè)

單寧對(duì)·OH、ABTS+·和DPPH·等自由基的清除能力檢測(cè)參照參考文獻(xiàn)[9]所提供的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

以核桃樹(shù)葉單寧的得率為指標(biāo)，在探索性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)，考察微波功率、微波處理時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶液用量和緩沖液pH值對(duì)單寧得率的影響，以確定提取單寧的最佳條件。

2.1.1 微波功率和處理時(shí)間的影響

在溫度60℃、酶液用量0.9%和緩沖液pH值為4的條件下將預(yù)處理液酶解100min。然后在微波功率分別為180、220、260、300 W的條件下進(jìn)行提取，不同微波提取時(shí)間下單寧得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1 微波處理時(shí)間和功率對(duì)單寧得率的影響Fig.1 Effects of microwave treatment time and powers on the tannin extraction yield

由圖1可知，微波功率對(duì)單寧的得率有較大影響，隨著功率的升高，單寧得率不斷升高。但12min后，功率為260 W的得率與300 W的相接近，考慮到生產(chǎn)成本，將功率確定為260 W。同時(shí)，從圖1中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)功率為260 W時(shí)，12min后，單寧得率增幅趨緩，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，得率曲線(xiàn)幾乎接近水平。這是因?yàn)槲⒉苁褂幸号蓊?lèi)的細(xì)胞瞬間膨脹破碎而將胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)，在提取初期，時(shí)間越長(zhǎng)，胞內(nèi)物質(zhì)釋放物越多[10]，單寧的得率也就越高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胞內(nèi)釋放物的含量逐漸減少，單寧得率增加不明顯。故將微波處理時(shí)間確定為12min。

2.1.2 緩沖液pH值和酶解時(shí)間對(duì)得率的影響

選取微波功率260 W、微波處理時(shí)間12min、酶解溫度60℃及酶液用量0.9%，考察不同酶解時(shí)間和緩沖液不同pH值對(duì)單寧得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 緩沖液pH值和酶解時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.2 Effects of buffer solution pH value and enzymatic time on the tannin extraction yield

結(jié)果如圖2所示，在酶解時(shí)間為100min、緩沖液pH值為4.0左右時(shí)的核桃樹(shù)葉單寧得率較高，而pH值低于或超過(guò)4.0后均較小。這可能是由于pH值為4.0左右時(shí)酶的活性較好的緣故，因此確定pH值為4.0。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，單寧得率逐漸增加，但當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)100min后單寧得率降低。這可以解釋為：一方面，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，單寧溶出的同時(shí)其它物質(zhì)的溶出量也會(huì)增加。另一方面，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也易使部分單寧類(lèi)物質(zhì)受到氧化等因素的影響而遭到破壞，從而導(dǎo)致得率降低[11]。故在本試驗(yàn)中選擇100min作為酶解時(shí)間較為合適。

2.1.3 酶解溫度和酶液用量對(duì)得率的影響

酶解溫度對(duì)單寧的活性與得率等有直接關(guān)系。選取50、55、60℃和65℃作為酶解溫度，在酶解時(shí)間100min、緩沖液pH值為4.0、微波功率260 W和微波處理時(shí)間12min的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，不同酶解溫度和酶液用量與核桃樹(shù)葉單寧得率的關(guān)系見(jiàn)圖3所示。

圖3 酶解溫度和酶液用量對(duì)得率的影響Fig.3 Effects of enzymatic temperature and enzyme solution dosages on the tannin extraction yield

從圖3中可見(jiàn)，相同條件下，酶解溫度為60℃時(shí)得率最高。這是因?yàn)殡S著溫度升高，酶的活性逐步增強(qiáng)，這有利于促進(jìn)細(xì)胞壁水解。但是溫度過(guò)高之后，酶活力會(huì)有所下降，部分酶甚至?xí)Щ?，從而影響得率[12]。由此可見(jiàn)，并不是酶解溫度越高越好，故在本試驗(yàn)中選取60℃作為酶解溫度。在60℃時(shí)，酶液用量較低時(shí)，單寧的得率隨著酶液用量的增加而增加明顯，當(dāng)酶液用量超過(guò)0.9%時(shí)，單寧得率增加緩慢。這可以解釋為當(dāng)酶的用量較大時(shí)，部分酶不能充分發(fā)揮作用所致。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析與優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了使單寧提取工藝更加合理與科學(xué)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)方法（RSM）進(jìn)行多因素的試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以提取單寧得率為考查目標(biāo)，選取微波功率、酶液用量、微波處理、酶解時(shí)間4個(gè)有重要影響的因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 RSM experiment design

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取在酶解溫度和緩沖液pH值分別為60℃和4.0，根據(jù)表1中的設(shè)計(jì)方案進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2所示。

2.2.2 多元回歸模型分析與驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用Design-Expert

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of RSM

7.1.6軟件進(jìn)行二次多元回歸分析，得到如表3所示的模型與方差。

續(xù)表3 模型與方差Continue table 3 Model and variance

從表3中可知，模型的P值＜0.000 1，表現(xiàn)為非常顯著，而失擬項(xiàng)P＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，且復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.929 1，接近1，這表明模型與實(shí)際情況吻合程度較高。同時(shí)，AB和BC的P值均小于＜0.05，表現(xiàn)出具有交互作用。

通過(guò)響應(yīng)面分析，可得到回歸方程（2）：

在回歸方程中，4個(gè)二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，表明所選的4個(gè)因素均具有最大值，且AB和BC等幾因素具有交互作用，其三維響應(yīng)面圖見(jiàn)圖4。

圖4 響應(yīng)面三維圖Fig.4 3D diagrams of RSM

從圖4（a）中可見(jiàn)，隨著酶液用量的增加，單寧得率增加緩慢，這可能是由于酶液達(dá)到一定量之后趨于飽和狀態(tài)而不能發(fā)揮作用所致；而隨著微波功率的增加，得率達(dá)到峰值后降低，這可以解釋為較大功率的微波會(huì)分解部分單寧。在圖4（b）中顯示了微波處理時(shí)間與酶液用量之間的交互關(guān)系，隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，但得率有降低的趨勢(shì)，這同樣可認(rèn)為是由于微波對(duì)單寧的分解所致。因此，在本試驗(yàn)條件下，應(yīng)該嚴(yán)格控制微波的功率與處理時(shí)間。

通過(guò)響應(yīng)面分析，得到較優(yōu)化的工藝參數(shù)為：微波功率249 W、酶液用量1.1%、微波處理時(shí)間10.04min、酶解時(shí)間101.24min，單寧的得率可達(dá)6.17%。為了便于試驗(yàn)控制，將微波功率、酶液用量、微波處理時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間及緩沖液pH值分別設(shè)置為250 W、1.1%、10min、60℃、100min和 4.0，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，3次平均得率為6.08%，與模型所預(yù)測(cè)的6.13%很接近，這表明所建立的回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)性。同時(shí)進(jìn)行對(duì)比性試驗(yàn)，其它條件相同，未采用微波處理的單寧得率僅為4.37%，兩者相差1.71%。

2.3 單寧性能分析

2.3.1 紅外光譜分析

將提取的核桃樹(shù)葉單寧進(jìn)行提純，然后進(jìn)行紅外光譜分析，其紅外譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of the extraction

由圖5可知，其最能表征單寧特性的紅外光帶為1610cm-1和1517cm-1附近的芳基環(huán)振動(dòng)；在1735cm-1附近有屬于苯基酯C=O伸縮振動(dòng)；1 445 cm-1為C-H變形和芳基環(huán)振動(dòng)；1 190、1 041 cm-1處為C-H的伸展振動(dòng)；在835 cm-1附近有吸收峰，說(shuō)明有苯環(huán)的存在；而760 cm-1附近的特征峰表明苯環(huán)上有多個(gè)取代結(jié)構(gòu)。此外，在3 400 cm-1附近峰形變得寬且強(qiáng)，屬于酚羥基O-H伸縮振動(dòng)；比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[13]發(fā)現(xiàn)提取物中含有單寧的主要成分——無(wú)色花翠素-3-葡萄糖苷分子結(jié)構(gòu)類(lèi)物質(zhì)。

2.3.2 抗氧化能力分析

為了對(duì)比分析單寧的抗氧化性能力，將水回流提取法、超聲波提取法及微波輔助纖維素酶法所得到的單寧對(duì)·OH、DPPH·和ABTS+·清除的情況進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同提取方法的單寧抗氧化能力Table 4 Antioxidant ability of tannin extracted with different method

由表4可知，在本試驗(yàn)條件下，采用微波輔助纖維素酶法提取單寧的IC50值分別為0.24、0.032 mg/mL和0.43 mg/mL，均遠(yuǎn)低于采用水回流提取法及超臨界萃取法所得到樣品的值，這表面其清除自由基的能力強(qiáng)。這可能是因?yàn)樵谒亓骱统R界提取過(guò)程中核桃樹(shù)葉單寧容易受到長(zhǎng)時(shí)間加熱、光照等外部條件的影響而發(fā)生氧化、異構(gòu)等變化所致[14]。而微波輔助纖維素酶工藝可使提取溫度降低、提取時(shí)間縮短、防止高溫下單寧的氧化，因此不會(huì)對(duì)單寧分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)有過(guò)大的影響，并能保持生物活性。

3 結(jié)論

1）采用微波輔助纖維素酶提取核桃樹(shù)葉單寧，與單獨(dú)使用酶法相比，不僅可以有效的提高單寧得率，而且還能縮短提取時(shí)間。

2）選擇酶解溫度和緩沖液pH值分別為60℃和4.0，最佳提取工藝條件為：微波功率250 W、酶液用量1.1%、微波處理時(shí)間10min、酶解時(shí)間100min。在此工藝條件下，核桃樹(shù)葉單寧的得率可達(dá)6.08%，比無(wú)微波輔助處理的提高了1.71%。

3）微波輔助纖維素酶法所提取的單寧具有較好的活性，對(duì)·OH、DPPH·和ABTS+·等自由基的清除能力均高于水回流提取法及超臨界提取法的樣品。

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