響應(yīng)面法優(yōu)化枳椇子三萜類化合物提取條件研究

（中國廣州分析測試中心，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510070）

枳椇（學(xué)名：Hovenia acerba）為鼠李科枳椇屬下的一個種。枳椇，為落葉闊葉高大喬木，樹高可達30 m，別名拐棗、雞爪梨、萬壽果、結(jié)肉子、結(jié)肉籽、桔扭子、雞爪樹、雞爪果、雞腳爪、萬字果、梨爪子等，我國大部份省區(qū)均有零星分布。枳椇子呈扁平圓形，背面稍隆起，腹面較平，直徑3 mm～5 mm，厚約2 mm。表面紅棕色至紅褐色，平滑光澤，基部有描圓形點狀的種臍，頂端有微凸的合點，腹面有一條縱行而隆起的種脊。種皮堅硬，厚約1 mm，胚乳乳白色，油質(zhì)，其內(nèi)包圍有2片肥厚的子葉，呈淡黃色至草綠色，亦油質(zhì)。氣微弱，味苦而澀，可清熱利尿，止咳除煩，解酒毒，具有醫(yī)療價值[1-2]。枳椇含有豐富的保健營養(yǎng)成分，現(xiàn)在國內(nèi)外常用來做解酒的飲料和預(yù)防肝炎的保健食品，應(yīng)用廣泛[3-5]。

三萜類化合物是一類具有廣泛抗腫瘤等生物活性的化合物，在自然界中分布廣泛[6-7]。其中具有顯著抗腫瘤活性的主要包括四環(huán)三萜和五環(huán)三萜。齊墩果酸和熊果酸是目前研究比較典型的五環(huán)三萜，由于三萜類化合物在與香草醛乙酸顯色情況下具有同等特性[8-10]，試驗以齊墩果酸為對照品，采用響應(yīng)面法優(yōu)化枳椇子中三萜類化合物的提取條件[11-16]，以期得到最佳的三萜類化合物提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枳椇子為枳椇種子烘干保存；齊墩果酸標準樣品（91.7%）：中國食品檢定研究院；冰乙酸、乙醇、香草醛、高氯酸：均為分析純；實驗室用水為去離子水。

UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9245A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；K-06B搖擺式粉碎機：廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 三萜類化合物標準溶液曲線的制定

精密稱取齊墩果酸標準樣品20 mg置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇超聲溶解后定容至刻度，搖勻的齊墩果酸標準溶液，每1 mL含0.2 mg齊墩果酸。精密吸取齊墩果酸標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL具塞比色管中，水浴蒸干，加入0.2 mL的5%香草醛-乙酸溶液和0.8 mL的高氯酸，在70℃水浴下反應(yīng)15min，冰水冷卻，加入4 mL冰醋酸后搖勻。在最大吸收峰548 nm波長處測定其吸光度，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得到標準曲線回歸方程為y=0.139 8x-0.001 6，式中：x為被測樣品中齊墩果酸的質(zhì)量；y為吸光度；相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 3。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

準確稱取一定量已處理好的枳椇子干粉，分別按一定的液料比，加入不同乙醇溶液，不同水浴溫度，不同提取時間平均分為兩次進行水浴回流提取后，過濾，定容至100 mL。

1.2.3 三萜類化合物提取率測定。

分別取一定量的提取液于具塞比色管中，按1.2.1方法測定波長在548 nm處的吸光度，根據(jù)回歸方程以及稱樣量計算出三萜類化合物的提取率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，選取影響提取三萜類化合物的4個因素：水浴溫度、液料比、提取時間、乙醇濃度進行響應(yīng)面優(yōu)化組合，因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and lenels in the Box-Benhnken

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 水浴溫度對三萜類化合物提取率的影響

取0.7 g處理好的枳椇子干粉，加入40 mL 60%乙醇溶液，分別在 50、60、70、80、90℃水浴溫度下提取3 h后，取0.2 mL提取液進行顯色測定吸光度，計算出三萜類化合物的提取率，結(jié)果如圖1。

圖1 水浴溫度對三萜類化合物提取的影響Fig.1 The effects of bath temperature on the extraction of triterpenoids

由圖1可看出，隨著水浴溫度的升高，三萜類化合物的提取率也升高，當達到70℃時，再升高水浴溫度，提取率逐漸下降，說明水浴溫度太高對其中三萜類化合物結(jié)構(gòu)造成破壞[7]。因此選擇水浴溫度為70℃。

2.1.2 液料比對三萜類化合物提取率的影響

分別準確稱取 0.4、0.5、0.7、0.8、1.0、1.3 g 處理好的枳椇子干粉，加入40 mL 60%乙醇溶液，液料比為100、80、60、50、40、30（mL/g），分別在 70℃水浴溫度下提取3 h后，取0.2 mL提取液進行顯色測定吸光度，計算出三萜類化合物的提取率，結(jié)果如圖2。

由圖2可看出，當液料比60 mL/g后隨著液料比的升高三萜類化合物含量上升緩慢。說明當液料比較低時，參與反應(yīng)的溶劑有限不能使試樣中的三萜類化合物完全提取出來，隨著液料比的增加，提取率也慢慢升高，當達到60 mL/g時，試劑與試樣的反應(yīng)比例達飽和狀態(tài)，液料比再提高后對反應(yīng)沒有增加效果[13]，因此選擇液料比為60 mL/g較佳。

圖2 液料比對三萜類化合物提取的影響Fig.2 The effects of liquid material ratio on the extraction of triterpenoids

2.1.3 水浴時間對三萜類化合物提取率的影響

取0.7 g處理好的枳椇子干粉，加入40 mL 60%乙醇溶液，在70℃水浴溫度下平均分為兩次提取，總提取時間為1、2、3、4、5 h 后，取 0.2 mL 提取液進行顯色測定吸光度，計算出三萜類化合物的提取率，結(jié)果如圖3。

圖3 水浴時間對三萜類化合物提取的影響Fig.3 The effects of bath time on the extraction of triterpenoids

由圖3可看出，當水浴時間為3 h后，隨著時間的延長三萜類化合物含量上升緩慢，說明提取初期，有效成分濃度差大，提取率增加明顯，當達到3 h后，溶劑中有效成分濃度小，提取率基本不變，因此，水浴時間選擇3 h。

2.1.4 不同乙醇濃度對三萜類化合物提取率的影響

取0.7 g處理好的枳椇子干粉，分別加入40 mL 40%，50%，60%，70%，80%乙醇溶液，在70℃水浴溫度下提取3 h后，取0.2 mL提取液進行顯色測定吸光度，計算出三萜類化合物的提取率，結(jié)果如圖4。

圖4 乙醇濃度對三萜類化合物提取的影響Fig.4 The effects of ethanol concentration on the extraction of triterpenoids

由圖4看出隨著乙醇濃度的增加對三萜類化合物的提取逐步提高，當達到60%時，提取率最佳。在濃度為80%后，三萜類化合物可能以苷和苷元兩種形式存在，苷溶于水，苷元溶于乙醇，乙醇過高或過低都不利于兩者的提取[16]。因此，選擇乙醇濃度為60%較佳。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗?zāi)Ｐ徒?/p>

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，優(yōu)化設(shè)計響應(yīng)面及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Designs and results of Box-Benhnken experimental

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗

通過Design Expert數(shù)據(jù)分析軟件進行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。

利用Design Exper軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析，對各因素擬合，得到三萜類化合物含量Y的回歸方程Y=+3.56－0.024A－0.035B+0.023C+0.078D+0.007 75AB－0.031AC－0.018AD+0.058BC+0.021BD－0.028CD－0.17A2－0.18B2－0.16C2－0.16D2。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

由表3 可知，該模型具有顯著性（P＜0.05），模型失擬項 0.069 8（＞0.05）不顯著，相關(guān)系數(shù) R2=0.954 1，說明回歸方程與實際數(shù)據(jù)間具有較好的擬合性，Radj2=0.908 2，說明可信度較高。從因素 A、B、C、D 對三萜類化合物含量的影響來看，B、D、BC、A2、B2、C2、D2均顯著。通過回歸方程一次項系數(shù)絕對值帶下判定本試驗中影響因素順序為D＞B＞A＞C；且 D，A2，B2，C2，D2均極顯著。

從圖5的殘差分布圖中可以看出29個試驗點基本分布在一條直線上，表明各試驗測得值之間相關(guān)性好，該模型可以很好的反應(yīng)各因素與三萜類化合物提取率之間的真實關(guān)系，再綜合圖表可以得出該回歸方程能夠?qū)憫?yīng)值進行預(yù)測分析。

圖5 三萜類化合物提取率的殘差分布圖Fig.5 The residual distribution of the extraction rate of triterpenoids

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程做響應(yīng)面圖和等高線圖，考察所擬合的響應(yīng)面的形狀，分析液料比、乙醇濃度、水浴溫度、水浴時間對三萜類化合物含量的影響，相應(yīng)的響應(yīng)面見圖6～圖11。

模型中A、B、C、D其中兩個因素固定在0水平，得到另外兩個因素間交互作用對三萜類化合物含量Y的子模型，綜合表和圖，進行二次多項回歸模型線性擬合后可知，枳椇子中三萜類化合物提取的最佳條件為：液料比59 mL/g，乙醇濃度62%，水浴溫度69℃，水浴時間183min，在此工藝下，枳椇子的三萜類化合物提取率為3.576 g/100 g。為驗證此工藝的優(yōu)化實際結(jié)果，進行該條件下的測試，得到實際值為3.582 g/100 g，所得試驗值與理論值相差小，說明經(jīng)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化設(shè)計的枳椇子提取三萜類化合物的條件是可信的，具有良好的使用價值。

圖6 水浴溫度和液料比對三萜類化合物提取率的影響Fig.6 Effects of bath temperature and liquid material ratio on the extraction rate of triterpenoids

圖7 水浴溫度和水浴時間對三萜類化合物提取率的影響Fig.7 Effects of bath temperature and bath time on the extraction rate of triterpenoids

圖8 水浴溫度和乙醇溶度對三萜類化合物提取率的影響Fig.8 Effects of bath temperature and ethanol concentration on the extraction rate of triterpenoids

圖9 液料比和水浴時間對三萜類化合物提取率的影響Fig.9 Effects of liquid material ratio and bath time on the extraction rate of triterpenoids

圖10 液料比和乙醇濃度對三萜類化合物提取率的影響Fig.10 Effects of liquid material ratio and ethanol concentration on the extraction rate of triterpenoids

圖11 水浴時間和乙醇溶度對三萜類化合物提取率的影響Fig.11 Effects of bath time and ethanol concentration and on the extraction rate of triterpenoids

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析方法，通過二次回歸設(shè)計得到枳椇子中三萜類化合物提取率與液料比、乙醇濃度、水浴溫度、水浴時間關(guān)系的回歸模型，從模型的響應(yīng)面對影響三萜類化合物提取率的因素之間相互作用進行了探討。得出各因素的主要影響關(guān)系為：乙醇濃度＞液料比＞水浴溫度＞水浴時間，并確定了提取的最佳條件為液料比59 mL/g，乙醇濃度62%，水浴溫度69℃，水浴時間183min，在此條件下得到三萜類化合物的含量為3.582 g/100 g，與其理論值相差較小。

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過Box-Behnken的中心組合設(shè)計及響應(yīng)面法對各個因素進行了分析，解決了正交試驗中只能單一分析的缺陷，得到了最佳提取工藝參數(shù)，具有模型預(yù)測性好、精確度高的優(yōu)點。

目前枳椇子在開發(fā)利用上僅僅局限于醒酒功能，在對其深入的功效成分開發(fā)上一直沒有更多的研究，三萜類化合物為具有重要的保健功效成分，枳椇子中三萜類化合物的提取為其在未來開發(fā)利用上提供了理論依據(jù)。

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