黃瓜籽總黃酮體外抗氧化作用

馮小雨，郝艷娟，蔡瑜，高江悅，曾橋安，徐斌

（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013）

黃瓜籽又名為哈力蘇，是葫蘆科植物黃瓜（Cucumis sativus L.）的種子，含有脂肪酸、植物甾醇、黃酮類、揮發(fā)油及礦物質(zhì)等生物活性物質(zhì)。具有消痰、祛風(fēng)、補鈣等功效[1－2]。黃酮類化合物具有清除人體自由基、抗衰老、抗腫瘤等作用，是應(yīng)用極為廣泛的抗氧化劑，它的藥理作用與抗氧化活性之間存在著密切聯(lián)系[3]。隨著黃瓜籽在現(xiàn)代中醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外學(xué)者對其的化學(xué)成分進行了大量的研究，但主要集中在黃瓜籽的游離脂肪酸、揮發(fā)油及礦物質(zhì)元素等方面[4－5]，目前對黃瓜籽黃酮提取及其抗氧化方面的研究較少，本文通過對黃瓜籽黃酮類物質(zhì)的提取及其體外抗氧化作用的研究，為其進一步的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃瓜籽：吉林市大福源一店；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl 2-trinitrohydrazine，DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；抗壞血酸（VC）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁Al（NO3）3、冰乙酸、丙酮、氫氧化鈉（NaOH）等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV-1750型紫外可見分光光度儀：日本島津儀器公司；TGL-20M離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；HZL-F100恒溫震蕩培養(yǎng)箱：太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考陳今朝[6]的方法進行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精確稱取0.010 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用95%的乙醇溶解并定容至50 mL，保存待用。分別取0.0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，補加95%乙醇至1.5 mL。分別于各試管中加入4%NaNO2溶液0.25 mL，靜置反應(yīng)6min，依次加入10%Al（NO3）3溶液0.25 mL，靜置反應(yīng)6min，最后于各管中加入4%NaOH溶液1.5 mL混勻。在波長510 nm處測得其吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（μg/mL）作為橫坐標(biāo)，吸光度（A）作為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 黃瓜籽中總黃酮的提取

參考于寒松等[7]方法，并稍加修改。稱取0.5 g黃瓜籽粉末，同時稱取3個平行樣置于離心管中，并加入15 mL酸性丙酮溶液（丙酮、蒸餾水與乙酸體積之比為70∶29.5∶0.5）后進行密封。常溫300 r/min恒溫震蕩3 h，對黃瓜籽樣品中的成分進行提取。恒溫震蕩結(jié)束以后，將黃瓜籽樣品提取液置于暗處12 h。在4 000 r/min條件下離心15min。取其上清液，于4℃冰箱保存，并盡快檢測。

1.3.3 樣品中總黃酮含量的測定

參考李有寶等[8]方法，并稍加修改。于試管分別加入0.5 mL空白樣（95%乙醇）、樣品提取液，并補加95%乙醇至1.5 mL。分別向各試管中加入臨用現(xiàn)配的4%NaNO2溶液0.25 mL，靜置6min后再次分別加入10%Al（NO3）3溶液0.25 mL，靜置6min，最后再加入4%NaOH溶液1.5 mL，混勻。于波長510 nm處測其吸光度值。

1.3.4 DPPH自由基清除作用測定

參照王陽等[9]方法進行黃瓜籽DPPH自由基清除作用的測定。各取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液及陽性對照抗壞血酸（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）于試管中，分別加入2 mL0.2 mmol/L的DPPH溶液，振蕩混合后，室溫避光反應(yīng)30min，在波長517 nm處測定吸光度值A(chǔ)X；以2 mL無水乙醇代替2 mL DPPH，測定吸光度值A(chǔ)i；以2 mL蒸餾水代替2 mL樣品，測定吸光度值A(chǔ)0。并按照下列公式計算出DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率/%=[A0-（AX-Ai）/A0]×100

1.3.5 羥自由基（·OH）清除作用測定

參考孫濤濤[10]的方法對黃瓜籽進行羥自由基清除作用的測定。各取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液及陽性對照抗壞血酸（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/mL）于試管中，各加入1 mL9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液與1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液，振蕩混勻，37℃水浴反應(yīng)1 h，在波長510 nm處測其吸光度值A(chǔ)1；以蒸餾水1 mL代替H2O21 mL，測定吸光度值A(chǔ)2；以蒸餾水1 mL代替樣品1 mL，測定吸光度值A(chǔ)0。按下列公式計算出羥自由基清除率：

羥自由基清除能力/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100

1.3.6 超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用測定

采用苗慧琴[11]的方法進行黃瓜籽超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用的測定。取3.2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液及陽性對照抗壞血酸（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL），依次加入 4.5 mL 50 mmol/L 的 Tris（三羥甲基氨基甲烷）-HCl緩沖液與0.3 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻反應(yīng)4min，加10 mmol/L的HCl 1 mL終止反應(yīng)，在波長325 nm處測吸光度值A(chǔ)x；以3.2 mL蒸餾水代替3.2 mL樣品測定吸光度值A(chǔ)0。按下列公式計算出超氧陰離子自由基清除率：

超氧陰離子自由基（O2-·）清除率/%=[（A0-AX）/A0]×100

1.3.7 總還原力的測定

參考羅敏等[12]的方法對黃瓜籽進行總還原能力的測定。取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）于試管中，加入 pH=6.6、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液2 mL與1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，混勻50℃水浴20min，加入10%三氯乙酸2 mL混勻，并于5 000 r/min的條件下離心10min，取2 mL上清液，并依次加入2 mL蒸餾水與0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應(yīng)10min后，以蒸餾水調(diào)零，在可見波長700 nm處測其吸光度值，平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜籽總黃酮含量的測定

根據(jù)1.3.1的試驗方法，制定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

得出的回歸方程為Y=0.003 3X-0.007 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，線性關(guān)系顯著，利用此線性方程并根據(jù)1.3.3的試驗方法測得黃瓜籽總黃酮的含量為6.49 mg/g。

2.2 黃瓜籽清除DPPH自由基能力

常用DPPH自由基的清除活性來表示化合物的抗氧化能力，DPPH自由基的清除率較高，說明樣品的抗氧化能力較強[13]。DPPH自由基本身呈紫色，經(jīng)與抗氧化劑作用轉(zhuǎn)變成黃色的穩(wěn)定化合物，在517 nm處有較強的吸收，如有自由基清除劑存在的前提下，DPPH自由基的單電子被分配，從而導(dǎo)致其顏色變淺，在最大吸收檢測波長處的吸光度值變小，利用比色法能夠很好的判斷自由基的清除情況[14-15]。黃瓜籽黃酮清除DPPH自由基能力見圖2。

圖2 黃瓜籽黃酮清除DPPH自由基能力Fig.2 The DPPH free radical scavenging ability of total flavnoids in cucumber seed

黃瓜籽黃酮有明顯的清除DPPH自由基的能力，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時陽性對照VC的清除能力為93.65%，黃瓜籽黃酮的清除能力為73.25%，說明黃瓜籽黃酮有一定的清除DPPH自由基能力，但是弱于陽性對照VC。

2.3 黃瓜籽清除超氧陰離子自由基能力

黃瓜籽黃酮清除超氧陰離子自由基能力見圖3。

圖3 黃瓜籽黃酮清除超氧陰離子自由基能力Fig.3 The Superoxide anion radical scavenging activity of total flavnoids in cucumber seed

黃瓜籽黃酮有明顯的清除超氧陰離子自由基的能力，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時陽性對照VC的清除能力為96.84%，黃瓜籽黃酮的清除能力為72.06%，說明黃瓜籽黃酮有一定的清除超氧陰離子自由基能力，但是弱于陽性對照VC。機體內(nèi)有一定數(shù)量的超氧陰離子自由基存在，它由體內(nèi)自身的氧化酶產(chǎn)生的，既不會發(fā)生化學(xué)變化也不會對機體造成危害。在有金屬離子的催化作用下發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有較高活性的羥基自由基，其產(chǎn)物會使細(xì)胞中DNA產(chǎn)生損壞，引起蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化性損傷，進而導(dǎo)致機體功能的破壞，因此，樣品對超氧陰離子自由基清除能力常常被用作反映其抗氧化活性高低的指標(biāo)[16-18]。本次試驗證明了黃瓜籽黃酮的體外抗氧化能力。

2.4 黃瓜籽黃酮清除羥自由基能力

研究表明[19-20]，羥自由基具有較強的氧化性，被認(rèn)為是機體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的啟動者，植物活性物質(zhì)對羥自由基的清除能力直接和它的抗氧化活性相關(guān)。黃瓜籽黃酮和陽性對照VC對羥自由基的清除能力如圖4所示。

圖4 黃瓜籽黃酮清除羥自由基能力Fig.4 The hydroxyl radical scavenging ability of total flavnoids in cucumber seed

在0～1.0 mg/mL測定的濃度范圍內(nèi)，黃瓜籽黃酮與陽性對照VC對羥自由基的清除率隨著濃度的增加而增大，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時陽性對照VC清除率可達(dá) 96.91%，黃瓜籽黃酮的清除率為71.63%，相較于陽性對照VC來說，黃瓜籽黃酮對羥自由基的清除能力較弱。

2.5 黃瓜籽黃酮總還原能力

總還原能力的強弱是用吸光度值的大小來衡量的，吸光度值越大表示其還原能力越強，它是用來評價化合物潛在抗氧化能力的指標(biāo)。還原能力較強的物質(zhì)，能夠提供更多的電子，其供應(yīng)的電子能夠參與自由基反應(yīng)將其變?yōu)榉€(wěn)定物質(zhì)[21－22]。黃瓜籽黃酮與陽性對照VC的總還原能力如圖5所示。

圖5 黃瓜籽黃酮總還原能力Fig.5 The total reduction capacity of total flavnoids in cucumber seed

在測定的濃度范圍內(nèi)，隨著黃瓜籽黃酮濃度的增加還原能力逐漸增強，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，陽性對照VC吸光度值為0.794，黃瓜籽黃酮的吸光度值為0.514，黃瓜籽黃酮的總還原能力弱于陽性對照VC。

3 結(jié)論

本試驗是以黃瓜籽為研究對象，以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)，并采用分光光度法測定黃瓜籽中總黃酮的含量，通過黃瓜籽黃酮對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥清除自由基及總還原能力的測定來評價其抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)，在測定的濃度范圍內(nèi)，黃瓜籽黃酮能夠?qū)PPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基有較強的清除作用，并隨著濃度的增加，總還原能力逐漸加強，表明黃瓜籽黃酮有較強的抗氧化活性。但由于本試驗中黃瓜籽黃酮提取物為粗提物，會對試驗結(jié)果有一定的影響。因此，在初步了解黃瓜籽總黃酮抗氧化活性的基礎(chǔ)上，對粗體物進行分離純化，篩選出有效活性的單體，進行更系統(tǒng)深入的研究提供方向。

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