ELISA對豬尿中沙丁胺醇的測定效果

李建鯤，王 彬，俞成山，劉冬梅

（1.昌吉回族自治州畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，新疆 昌吉 831100；2.阜康市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 阜康 831500；3.木壘縣動物疾控中心，新疆 木壘 831900）

沙丁胺醇（Salbutamol，Sal）是一種苯酚胺類β-腎上腺素興奮劑類藥物，可以促進(jìn)脂肪降解和蛋白質(zhì)合成，具有一定的促生長作用，在畜牧養(yǎng)殖中能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，但是沙丁胺醇易在畜禽體內(nèi)蓄積，會影響甚至危害人們健康，我國農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布公告，規(guī)定沙丁胺醇等6種β2-腎上腺素受體激動劑獸藥禁用，并且在所有食用動物的可食組織中不得檢出。

1 材料和方法

1.1 試劑

1.1.1 酶聯(lián)免疫試劑盒（KA06204H）北京勤邦生物技術(shù)公司。

1.1.2 水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。

1.2 儀器設(shè)備

（1）酶標(biāo)分析儀 318C+ 上海沛歐分析儀器

（2）渦旋儀 IKA MS3 basic 德國

（3）離心機(jī) 2-16A TOMOS

（4）電熱恒溫培養(yǎng)箱 DHP-360 永光明醫(yī)療儀器廠

1.3 試劑配制

洗滌工作液：用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃（39.2°F）環(huán)境可保存一個月。

1.4 樣品制備

取適量新鮮、清亮空白或供試豬尿（如豬尿渾濁必須通過過濾或 3000g以上，室溫（20～25℃/68～77°F）離心 10min直至清亮），暫不使用的樣本應(yīng)于-20℃（-4°F）冷凍保存。稀釋系數(shù)：1

1.5 測定（20～25℃條件下進(jìn)行操作）

1.5.1 將所需試劑和供試樣品回升至室溫20～25℃。

1.5.2 編號：將所需數(shù)量的孔條插入微孔架，對樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的微孔按序編號，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個平行實(shí)驗(yàn)，記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。

1.5.3 酶結(jié)合物工作液配制：將酶結(jié)合物濃縮液用酶結(jié)合物稀釋液按照1：10體積比進(jìn)行稀釋（1份酶結(jié)合物濃縮液加入10份酶結(jié)合物稀釋液）

1.5.4 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和酶標(biāo)記物工作液：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品20μL到對應(yīng)的微孔中，然后加入酶結(jié)合物工作液80μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃（77°F）避光環(huán)境中反應(yīng)30min。

1.5.5 洗板：小心揭開蓋膜板，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，倒掉板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用的槍頭戳破）。

1.5.6 顯色：加入底物液A 50μL/孔，再加入底物液B 50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋膜板蓋板后置25℃（77°F）避光環(huán)境中反應(yīng)15min。

1.5.7 測定：加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔的OD值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 利用RIDAWIN軟件計(jì)算供試樣品中沙丁胺醇含量。

1.6.2 測得的沙丁胺醇含量使用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果顯示，豬尿中1、2、4和8ng/mL 4個不同濃度沙丁胺醇的添加回收率在86.0%～94.5%，精密度在3.9%～11.6%，當(dāng)沙丁胺醇添加濃度較低時回收率偏低而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差偏高，可能是由于在制備供試液時用較大量程加樣器（10～100μL）移取少量高濃度標(biāo)準(zhǔn)品時產(chǎn)生誤差，建議在實(shí)際操作中采用適當(dāng)量程的加樣器移取測試液，盡量減小誤差或避免產(chǎn)生誤差。從檢測的情況來看，檢測結(jié)果相對可靠、穩(wěn)定，能夠滿足基層檢測部門初檢篩選要求。

表1 豬尿中不同濃度沙丁胺醇的添加回收率

3 結(jié)論與討論

從樣品采集特性和檢測方法的適用性角度來看，豬尿便于酶聯(lián)免疫試劑盒等快檢產(chǎn)品檢測，且檢測方法操作簡單，反應(yīng)靈敏，結(jié)果相對穩(wěn)定、可靠，因此，建議養(yǎng)殖環(huán)節(jié)基層檢測部門采用ELISA法對豬尿進(jìn)行初檢篩選，如此不僅可以提高檢測工作效率，同時也會對違法使用沙丁胺醇行為起到一定的震懾作用。