偽狂犬病PCR檢測(cè)方法的建立

王皓婷 ，紀(jì)愛英，程 龍★，張彥昌 ，袁 英，孫 岐 ，趙素杏，陳清亮

(1.河北省邯鄲市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 邯鄲 056000；2.河北省邯鄲市飼料工業(yè)辦公室，河北 邯鄲 056000)

本病是一種可侵害多系統(tǒng)的急性傳染病，由偽狂犬病病毒引起。由于凈化難度較大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。能夠快速區(qū)分野毒和疫苗株對(duì)偽狂犬病凈化有著十分重要的意義。PCR檢測(cè)方法與ELISA檢測(cè)方法相較，有準(zhǔn)確、快速、易于操作等優(yōu)點(diǎn)。本方法可以區(qū)分野毒感染與被動(dòng)免疫，經(jīng)優(yōu)化各項(xiàng)反應(yīng)條件后，測(cè)得本試驗(yàn)最低檢測(cè)模板量為3.75pg/μL，敏感性較高，目的條帶長(zhǎng)度為597bp。

1 材料

1.1 參考序列

Gen Bank數(shù)據(jù)庫中偽狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株序列。

1.2 病毒DNA

本研究中所使用的偽狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)毒DNA由河北工程大學(xué)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3 試劑

Taq DNA 聚合酶、dNTPs（2.5mM）、10×PCR buffer、瓊脂糖、DL2000 DNA Marker等均購自大連寶生物工程公司，設(shè)計(jì)好的引物委托大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 主要儀器

臺(tái)式離心機(jī)MiniSpin Eppendorf;移液器Eppendorf/大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司;PCR儀GeneAmp 9700Life Technologies(AB&Invitrogen);電泳儀DYY-8C凝膠成像系統(tǒng)/北京六一生物科技有限公司

1.5 病料采集

從邯鄲市各縣區(qū)選取豬場(chǎng)采集病料共計(jì)200份。所采豬只均出現(xiàn)有呼吸道癥狀、發(fā)熱等異常情況。病料種類有肺臟，延髓，脾臟，腎臟和淋巴結(jié)等，對(duì)所采集病料按場(chǎng)點(diǎn)分類、編號(hào)。

2 方法

2.1 設(shè)計(jì)引物

偽狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗因免疫效果較好而得到廣泛使用。是否包含gE基因是野毒株與疫苗株最大的區(qū)別。本試驗(yàn)針對(duì)偽狂犬病毒gE基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為597bp。

PRV：（PRV1）5’-ACACACCGGGGTTGAG-3’

（PRV2）5’-TGCAGCGTGTAGAGGC-3’

2.2 病毒DNA的提取

運(yùn)用世紀(jì)元亨豬偽狂犬病病毒PCR檢測(cè)試劑盒中的DNA提取柱按說明書步驟提取病毒DNA。

2.3 PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建

以偽狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)毒DNA作為反應(yīng)模板，構(gòu)建擴(kuò)增體系，總體積為 25μL：（1）PRV DNA 2μL；（2）上下游引物各 0.8μL；2×GC buffe 12.5μL；Taq DNA 聚合酶 0.5μL；dNTPs（2.5mM）3μL；滅菌雙蒸水 5.4μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5min；循環(huán)：94℃變性45s，52℃ 退火 30s，72℃ 延伸 1min，共 35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取10μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)退火溫度和引物的加入量進(jìn)行摸索，以確定上述PCR體系的最佳反應(yīng)條件。表1為PRV PCR反應(yīng)體系的各項(xiàng)摸索內(nèi)容。

2.5 敏感性試驗(yàn)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取出的PRV DNA的濃度并記錄。隨后取5μLDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，直至稀釋到10-6。從稀釋度為 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液中各取 2 μL作為模板，在其它反應(yīng)條件相同的情況下分別進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物各取10μL，同時(shí)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)比結(jié)果，檢測(cè)本方法的敏感性。

2.6 特異性試驗(yàn)

待所有條件均摸索好、確定最佳反應(yīng)體系后，分別以PRV的 DNA、雙蒸水、CSF的 cDNA、PCV2的 DNA、PRRSV的cDNA、JEV的cDNA為模板，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，用以驗(yàn)證本方法的特異性。

2.7 陽性檢出率試驗(yàn)

表1 PRV PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

用本試驗(yàn)建立的PCR方法對(duì)收集的病料進(jìn)行檢測(cè)并記錄陽性率，再使用世紀(jì)元亨豬偽狂犬病病毒PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的符合率。

3 結(jié)果

3.1 PRV PCR方法建立的結(jié)果

將PRV標(biāo)準(zhǔn)毒的DNA做為模板，運(yùn)用本試驗(yàn)建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，所得條帶大小在500bp～750bp之間（見圖1）。測(cè)序鑒定無誤，目的條帶為597bp，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PRV PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.2 PRV PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 確定最適退火溫度

在各種選定的退火溫度下都能擴(kuò)增出特異性條帶，但在53℃時(shí)，擴(kuò)增出的條帶相比其他溫度最亮（圖2），因此將最適退火溫度定為53℃。

圖2 PRV PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

3.2.2 確定最佳引物量

加入引物（10μmol/L）量為0.7 μL時(shí)，出現(xiàn)的特異性條帶最亮（圖3），擴(kuò)增效果最好，但其它濃度亦可擴(kuò)增出目的條帶。

圖3 PRV PCR引物量?jī)?yōu)化結(jié)果

3.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)紫外分光光度計(jì)側(cè)得PRV的DNA模板的起始濃度為 37.5ng/μL，結(jié)果如圖 4 所示，稀釋度為 10-2、10-3、10-4、10-5時(shí)均可擴(kuò)增出特異性條帶。經(jīng)計(jì)算得知，最低檢測(cè)量為3.75pg/μL。

圖4 PRV PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

分別以雙蒸水、PRV的 DNA、CSF的 cDNA、PRRSV的cDNA、PCV2的DNA、JEV的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖5所示，僅有PRV的DNA擴(kuò)增出了特異性條帶，說明本試驗(yàn)特異性較好。

圖5 PRV PCR特異性測(cè)定結(jié)果

3.5 陽性符合率檢測(cè)結(jié)果

分別使用世紀(jì)元亨試劑盒和本試驗(yàn)建立的建立的檢測(cè)方法對(duì)200份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其中世紀(jì)元亨的檢出數(shù)為78份，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法的檢出數(shù)為76份，說明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)方法與世紀(jì)元亨的檢測(cè)結(jié)果有較高的陽性符合率。

4 討論

4.1 本試驗(yàn)為偽狂犬病病毒PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)摸索性試驗(yàn)，后續(xù)可考慮加入野毒株與疫苗株都具備的基因，如gB基因、gD基因等其他基因片段，與gE基因同時(shí)擴(kuò)增。雙基因的擴(kuò)增可很好的避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

4.2 可進(jìn)一步探究偽狂犬病病毒基因與其它豬DNA病毒（如豬瘟等）基因一同擴(kuò)增，建立多重PCR檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)多種病種，提高檢測(cè)效率。