基于蒙特卡洛法評(píng)定轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的測(cè)量不確定度

宋 君，常麗娟，陶 李，張富麗，王 東(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

【研究意義】由于價(jià)格和消費(fèi)者的接受程度等因素影響以及相關(guān)法律規(guī)定，人們需要區(qū)分轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品與非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品以及知道產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。目前，轉(zhuǎn)基因成分的鑒定一般可以采用檢測(cè)外源基因(核酸)和外源蛋白質(zhì)的方法實(shí)現(xiàn)[1-2]，而轉(zhuǎn)基因成分的精準(zhǔn)定量目前得到世界廣泛認(rèn)可的方法是采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。近年，轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的檢測(cè)方法研究，普遍集中在轉(zhuǎn)化事件的終點(diǎn)PCR法和實(shí)時(shí)PCR法[3-5]。此外，有轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的傳感器方法、質(zhì)譜法、近紅外光譜法等報(bào)道，但因成本高、儀器設(shè)備配置要求高、可操作性低等原因未得到廣泛推廣應(yīng)用。近20年來(lái)，人們對(duì)基于DNA的轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)研究非常重視[6-8]，建立的部分轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)方法已經(jīng)非常成熟且上升為國(guó)際、國(guó)內(nèi)檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)并在實(shí)踐中大量應(yīng)用，但卻忽略了這些方法在應(yīng)用中的質(zhì)量保證研究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有報(bào)道指出轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)結(jié)果與理論值的相對(duì)偏差不高于25 %就能被廣泛接受[9]，而且隨著轉(zhuǎn)基因成分含量的降低，檢測(cè)結(jié)果偏差將會(huì)上升。是何原因?qū)е罗D(zhuǎn)基因成分定量有較高的相對(duì)偏差，影響因素是有哪些，影響因素的貢獻(xiàn)大小是多少，如何提高轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)質(zhì)量。截止目前，尚無(wú)針對(duì)上述問(wèn)題的研究報(bào)道。轉(zhuǎn)基因玉米MIR604是由美國(guó)先正達(dá)種子公司(Syngenta Seeds Inc.)開(kāi)發(fā)的的一種抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米，該品系包含由啟動(dòng)子MTL和終止子NOS調(diào)控的抗蟲(chóng)基因Cry3A和由啟動(dòng)子Ubi Zm1、終止子NOS調(diào)控的標(biāo)記基因pmi。2006年該品系經(jīng)過(guò)安全評(píng)價(jià)作為食品和飼料加工原材料首次在澳大利亞和新西蘭市場(chǎng)投放。自2007年開(kāi)始，包括美國(guó)、加拿大、日本、阿根廷和巴西在內(nèi)共有5個(gè)國(guó)家進(jìn)行商業(yè)化種植MIR604玉米品系(http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=131)。我國(guó)自2008年開(kāi)始批準(zhǔn)進(jìn)口該轉(zhuǎn)玉米品系用作食品和飼料的加工原材料，禁止商業(yè)化種植?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】常麗娟等針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604品系外源基因的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物和探針[10]，建立了成熟的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604品系的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法并確認(rèn)了該法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR604品系的特異性和靈敏度(達(dá)到5拷貝數(shù))。測(cè)量不確定度是評(píng)估檢測(cè)質(zhì)量的重要參數(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的測(cè)量不確定評(píng)定研究，可發(fā)現(xiàn)影響檢測(cè)質(zhì)量的因素，并能將影響因素對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)值化定量分析，找到影響檢測(cè)質(zhì)量最大的“干擾因子”，從而有針對(duì)性地改進(jìn)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)和步驟，提高轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)質(zhì)量。本文首次采用蒙特卡洛方法(Monte Carlo Method, MCM)開(kāi)展轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的測(cè)量不確定度評(píng)定研究，回答并解決長(zhǎng)期困擾影響轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)質(zhì)量的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

校準(zhǔn)定量PCR儀(擬合校準(zhǔn)曲線(xiàn))的校準(zhǔn)子(Calibrator)為10 %的轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因組DNA的5個(gè)梯度濃度稀釋液；1 %含量轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9的標(biāo)準(zhǔn)品作為測(cè)試樣品；DNA分離和定量PCR試劑采用TIANGEN生化科技有限公司(北京)生產(chǎn)的高效植物基因組DNA 提取試劑盒和SuperReal PreMix (Probe)試劑盒；實(shí)驗(yàn)中使用到引物/探針序列(上海生工合成和標(biāo)記)參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[10]；本研究用到的主要儀器有超微量分光光度計(jì)(Nanodrop-1000, Thermo, USA)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500，ABI, USA)，分別測(cè)量分離、純化到的DNA溶液質(zhì)量(濃度、純度和完整性)和擴(kuò)增、測(cè)量玉米內(nèi)源基因(zSSIIb)、轉(zhuǎn)基因玉米MIR604片段及其絕對(duì)含量。

1.2 DNA提取

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試樣DNA的分離、純化以及PCR反應(yīng)體系配置，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合和試樣測(cè)量

把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA的溶液分別稀釋成105、21、4.2、0.84和0.17 ng/μl，然后用上述4 μl系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA溶液[按照玉米基因組大小(5×109base) pairs][11]計(jì)算，分別相當(dāng)于1.9×106、4×105、8×104、1.6×104、3.2×103copies DNA分子)的對(duì)數(shù)值(校準(zhǔn)子)及其PCR儀檢測(cè)到的響應(yīng)Ct值(校準(zhǔn)子)作為擬合zSSIIb基因、MIR604片段校準(zhǔn)曲線(xiàn)的輸入量。試樣DNA溶液稀釋到12.5 ng/μl。PCR反應(yīng)體系含4 μl標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA溶液或試樣溶液、2×主混液10 μl，上、下游引物各0.5 μM，探針0.25 μM，滅菌水補(bǔ)至20 μl。每個(gè)DNA濃度點(diǎn)做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)；試樣重復(fù)做24次測(cè)量。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；59 ℃，1 min(45 cycles)。

1.4 數(shù)學(xué)測(cè)量模型和不確定度評(píng)定

轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的測(cè)量分為3個(gè)階段，包含3個(gè)數(shù)學(xué)模型。

第1階段是按照(1)式(數(shù)學(xué)模型)擬合zSSIIb基因和MIR604片段的校準(zhǔn)曲線(xiàn):

Ct=m×lgA+k

(1)

式中，A為zSSIIb基因或MIR604片段的已知量，Ct為A的儀器響應(yīng)值(threshold of cycles,Ct)，二者作為擬合曲線(xiàn)的輸入量；k和m分別為校準(zhǔn)曲線(xiàn)的輸出量截距和斜率。

第2階段是把PCR儀檢測(cè)到的試樣zSSIIb基因和MIR604片段的Ct值作為輸入量代入(2)式(校準(zhǔn)曲線(xiàn)方程的變形式)，計(jì)算獲得試樣zSSIIb基因和MIR604片段的絕對(duì)量:

A=10(Ct-k)/m

(2)

第3階段是把試樣zSSIIb基因和MIR604片段的絕對(duì)量作為輸入量代入(3)式計(jì)算獲得試樣中轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的相對(duì)百分含量C輸出量:

C=A外/A內(nèi)×100 %

(3)

式中，A外和A內(nèi)分別為試樣中MIR604片段和zSSIIb基因的絕對(duì)量。

按照ISO-GUM Supp1[12]，采用MCM進(jìn)行概率分布傳遞來(lái)評(píng)定轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的測(cè)量不確定度。編寫(xiě)MATLAB代碼實(shí)現(xiàn)評(píng)定過(guò)程中的抽樣、計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 輸入量PDF的設(shè)定和抽樣

本研究涉及到的輸入量包括用于PCR儀校準(zhǔn)的系列校準(zhǔn)子(Cti)、校準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率(m)和截距(k)、試樣內(nèi)/外源基因Ct值、試樣內(nèi)/外源基因絕對(duì)含量(A內(nèi)/A外)，其中校準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率(m)和截距(k)、試樣內(nèi)/外源基因絕對(duì)含量(A內(nèi)/A外)在不同的階段既作為輸入量同時(shí)也作為輸出量。

表1 zSSIIb內(nèi)源基因校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合Table 1 Fitting of calibration curve for endogenous gene zSSIIb

表2 MIR604片段校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合Table 2 Fitting of calibration curve for MIR604 fragment

PCR儀校準(zhǔn)的系列校準(zhǔn)子(Cti)(表1～2)、試樣內(nèi)/外源基因Ct值(表3)的PDF遵守均勻分布R(a,b)(a為均勻分布的下限，b均勻分布的上限)，從標(biāo)準(zhǔn)均勻分布R(0，1)中抽取隨機(jī)數(shù)r，對(duì)任意值ξ，滿(mǎn)足ξ=a+(b-a)r；試樣內(nèi)/外源基因絕對(duì)含量(A內(nèi)/A外)的PDF設(shè)定為正態(tài)分布N[y,u2(y)] [y為最佳估計(jì)值，u(y)為標(biāo)準(zhǔn)不確定度]，從標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布N(0，1)中抽取隨機(jī)數(shù)r，對(duì)任意值ξ，構(gòu)造ξ=y+u(y)r；由于校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率m和截距k是2個(gè)相關(guān)聯(lián)的量。因此，m和k的PDF設(shè)定為雙元正態(tài)聯(lián)合，按照J(rèn)CGM 101:2008[12]、JCGM 102:2011[13]規(guī)定和Sega[14]報(bào)道的方法處理。各輸入量的分布類(lèi)型、均值和包含區(qū)間見(jiàn)表4。

表3 試樣中內(nèi)源基因zSSIIb和MIR604片段的Ct值Table 3 Ct values of endogenous gene zSSIIb and MIR604 fragment in the sample

表4 各輸入/輸出量的分布及不確定度和95 %包含概率的包含區(qū)間Table 4 The probability distribution of all inputs and outputs and their 95 % coverage intervals

續(xù)表4 Continued table 4

影響因子或輸入/出量概率分布平均值標(biāo)準(zhǔn)不確定度包含概率為95 %包含區(qū)間Ct_S10均勻分布24.320.2023.99^24.65Ct_S11均勻分布24.290.2023.96^24.62Ct_S12均勻分布24.360.2024.03^24.69Ct_S13均勻分布24.550.2024.22^24.88Ct_S14均勻分布24.490.2024.16^24.82Ct_S15均勻分布24.470.2024.14^24.80Ct_S16均勻分布24.740.2024.41^25.07Ct_S17均勻分布24.690.2024.36^25.02Ct_S18均勻分布24.570.2024.24^24.90Ct_S19均勻分布24.700.2024.37^25.03Ct_S20均勻分布24.730.2024.40^25.06Ct_S21均勻分布24.610.2024.28^24.94Ct_S22均勻分布24.730.2024.40^25.06Ct_S23均勻分布24.690.2024.36^25.02Ct_S24均勻分布24.760.2024.43^25.09Ct_S1#均勻分布32.790.1832.49^33.09Ct_S2#均勻分布32.700.1832.40^33.00Ct_S3#均勻分布32.510.1832.21^32.81Ct_S4#均勻分布32.490.1832.19^32.79Ct_S5#均勻分布32.600.1832.30^32.90Ct_S6#均勻分布32.290.1831.99^32.59Ct_S7#均勻分布32.700.1832.40^33.00Ct_S8#均勻分布32.380.1832.08^32.68Ct_S9#均勻分布32.570.1832.27^32.87Ct_S10#均勻分布32.130.1831.83^32.43Ct_S11#均勻分布32.440.1832.14^32.74Ct_S12#均勻分布32.430.1832.13^32.73Ct_S13#均勻分布32.600.1832.30^32.90Ct_S14#均勻分布32.610.1832.31^32.91Ct_S15#均勻分布32.610.1832.31^32.91Ct_S16#均勻分布32.560.1832.26^32.86Ct_S17#均勻分布32.540.1832.24^32.84Ct_S18#均勻分布32.450.1832.15^32.75Ct_S19#均勻分布32.770.1832.47^33.07Ct_S20#均勻分布32.470.1832.17^32.77Ct_S21#均勻分布32.570.1832.27^32.87Ct_S22#均勻分布32.980.1832.68^33.28Ct_S23#均勻分布32.880.1832.58^33.18Ct_S24#均勻分布32.680.1832.38^32.98Q_zSSIIb正態(tài)分布141.573.93133.86^149.27Q_MIR604正態(tài)分布1.400.041.33^1.48C正態(tài)分布0.00993.76×10-40.0092^0.0107

注：a.Ct11～Ct53(統(tǒng)稱(chēng)Cti)表示zSSIIb基因測(cè)量中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各濃度點(diǎn)的響應(yīng)值；b.Ct11#～Ct53#(統(tǒng)稱(chēng)Cti#)表示59122測(cè)量中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各濃度點(diǎn)的響應(yīng)值；c.Ct_S1～Ct_S24(統(tǒng)稱(chēng)Ct_Si)表示試樣24次重復(fù)測(cè)量zSSIIb基因獲得的Ct值；d.Ct_S1#～Ct_S24#(統(tǒng)稱(chēng)Ct_Si#)表示試樣24次重復(fù)測(cè)量59122片段獲得的Ct值；e.Q_zSSIIb表示試樣中zSSIIb的絕對(duì)含量；f.Q_MIR604表示試樣中59122片段的絕對(duì)含量；g.C表示試樣中59122片段的相對(duì)含量；h.mzSSIIb和mMIR604分別zSSIIb基因和MIR604片段的校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率；i.kzSSIIb和kMIR604分別zSSIIb基因和MIR604片段的校準(zhǔn)曲線(xiàn)的截距。

圖1 MIR604玉米相對(duì)含量的概率分布Fig.1 The plot of probability distribution for relative content of MIR604 maize

2.2 PDF傳遞和輸出

從2.1中各輸入量的 PDF中抽取106個(gè)樣本值，對(duì)每個(gè)樣本向量計(jì)算相應(yīng)的測(cè)量模型值。將106個(gè)模型值按照嚴(yán)格遞增次序排序從而得到輸出量的PDF、均值和包含區(qū)間。

3 討 論

本研究首次使用MCM法實(shí)施各影響因素的“概率分布傳播”來(lái)評(píng)定轉(zhuǎn)基因成分的測(cè)量不確定度。本實(shí)驗(yàn)混合樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的相對(duì)含量為0.99 %接近理論含量1 %，相對(duì)偏差為1 %，小于常麗娟等[10]報(bào)道結(jié)果(1.05 %)的相對(duì)偏差(5 %)。本次混合樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的相對(duì)含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為3.76×10-4，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于理化分析中不確定度的可接受水平(10 %)。程序計(jì)算獲得的包含概率為95 %條件下的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的相對(duì)含量包含區(qū)間為2.91 %～3.00 %，即轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的相對(duì)含量落在2.91 %～3.00 %非常窄的范圍內(nèi)的概率為95 %，充分顯示本實(shí)驗(yàn)的測(cè)量質(zhì)量非常高，測(cè)量數(shù)據(jù)非?？煽?。

開(kāi)展測(cè)量不確定度評(píng)定的目的是了解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響測(cè)量結(jié)果的因素及其大小。轉(zhuǎn)基因成分定量分析包括樣品制備、DNA提取、PCR擴(kuò)增、校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合和轉(zhuǎn)基因成分含量計(jì)算等步驟。每一個(gè)步驟都可能包含了一些不確定度成分，目前在樣品制備、DNA提取階段，由于尚未建立科學(xué)的測(cè)量模型(數(shù)學(xué)模型)，所以很難對(duì)樣品制備和DNA提取階段的不確定度成分進(jìn)行量化評(píng)定。本文僅對(duì)校準(zhǔn)曲線(xiàn)制備、PCR擴(kuò)增和含量計(jì)算等步驟產(chǎn)生的不確定度成分進(jìn)行量化評(píng)估。從表4反應(yīng)的各不確定度成分貢獻(xiàn)大小依次(從大到小)為玉米內(nèi)源基因zSSIIb絕對(duì)含量不確定度3.93，濃度點(diǎn)4.2 ng/μl稀釋產(chǎn)生的不確定0.32(相同濃度點(diǎn)對(duì)應(yīng)于外源片段Ct值的也有較大的不確定度0.21)，測(cè)試樣品內(nèi)源基因Ct值不確定度0.20，測(cè)試樣品外源片段Ct值不確定度0.18，濃度點(diǎn)21 ng/μl處外源片段Ct值的不確定0.17，其余不確定度都小于0.1，最終輸出量轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的相對(duì)含量C的不確定度極小。本次評(píng)定的不確定大小反應(yīng)出除最大的玉米內(nèi)源基因zSSIIb絕對(duì)含量不確定度(因各種不可控因素影響一般不用絕對(duì)含量作為轉(zhuǎn)基因含量)外，主要影響轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)質(zhì)量的不確定度成分是校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合過(guò)程中校準(zhǔn)子制備產(chǎn)生的不確定度(0.32)。影響校準(zhǔn)子制備的因素為液體轉(zhuǎn)移量的準(zhǔn)確性。因此，提高轉(zhuǎn)基因成分定量分析質(zhì)量的關(guān)鍵因素提高實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的液體轉(zhuǎn)移量的準(zhǔn)確度。

4 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)基于MATLAB軟件編寫(xiě)的程序代碼模擬106次抽樣、計(jì)算、傳遞各個(gè)變量的PDF，獲得了混合樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR604的相對(duì)含量C(最終輸出量)的PDF和不確定度。測(cè)量過(guò)程的所有輸入/出量的PDF、最佳估計(jì)值、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和95 %包含概率的包含區(qū)間結(jié)果見(jiàn)表4。zSSIIb基因和MIR604片段的校準(zhǔn)曲線(xiàn)分別為y=-3.38x+31.74和y=-3.30x+33.06。Q_zSSIIb和Q_MIR604絕對(duì)含量的平均值分別為141.57和1.40，標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為3.93和0.04，95 %包含概率的包含區(qū)間分別為133.86～149.27和1.33～1.48。MIR604片段相對(duì)含量C的平均值、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和95 %包含概率的包含區(qū)間分別為0.99 %、3.76×10-4和0.92 %～1.07 %。圖1為經(jīng)MATLAB程序運(yùn)行產(chǎn)生的呈正態(tài)分布的轉(zhuǎn)基因玉米MIR604相對(duì)含量的概率密度。所有成分中，不確定度貢獻(xiàn)最大的成分是是液體轉(zhuǎn)移量的偏差。因此，液體轉(zhuǎn)移量的準(zhǔn)確度是提高轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵。

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