中草藥飼料添加劑對(duì)異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的影響

沈兆媛，魯建飛，許 丹，3，呂利群，3

( 1.上海海洋大學(xué)，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306 )

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，鯽魚(yú)人工養(yǎng)殖總產(chǎn)量約2.0×106t，其主要養(yǎng)殖品種是異育銀鯽[1]。隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量的增長(zhǎng)及養(yǎng)殖區(qū)域的擴(kuò)大，日益惡劣的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境使得鯽魚(yú)病害頻繁發(fā)生。近幾年來(lái)給江蘇地區(qū)鯽魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)極大困擾的Ⅱ型鯉皰疹病毒，是高致病性病毒病皰疹病毒性造血器官壞死病的致病病原[2-3]。除Ⅱ型鯉皰疹病毒對(duì)鯉科魚(yú)類(lèi)造成較大的危害外，Ⅰ型鯉皰疹病毒和Ⅲ型鯉皰疹病毒對(duì)鯽魚(yú)及金魚(yú)(Carassiusauratus)養(yǎng)殖亦有一定危害。Ⅰ型鯉皰疹病毒引發(fā)鯉痘瘡，Ⅲ型鯉皰疹病毒感染鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)和錦鯉(C.carpiovar. koi)且有極高的致死率[4]。Ⅱ型鯉皰疹病毒感染鯽魚(yú)后，可在魚(yú)體表、鰓、脾臟、腎臟等組織器官明顯觀察到出血癥狀。

目前采用有效的藥物治療感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的鯽魚(yú)尚未見(jiàn)報(bào)道。中草藥應(yīng)用于中國(guó)人類(lèi)醫(yī)療中歷史悠久，因其兼具營(yíng)養(yǎng)性及藥用性的雙重作用受到人們的廣泛關(guān)注[5]。中草藥添加劑與抗生素和其他化合物添加劑相比，其優(yōu)勢(shì)在于成本低、藥物殘留及副作用小、資源豐富。水產(chǎn)養(yǎng)殖中用來(lái)抑制病原菌繁殖，增強(qiáng)非特異性免疫的中草藥有穿心蓮(Andrographispaniculata)、五倍子(Melaphischinensis)、當(dāng)歸(Angelicasinensis)、 金銀花(Lonicerajaponica)、魚(yú)腥草(Houttuyniacordata)、黃芪(Astragalus)、黃芩(Scutellariabaicalensis)、大蒜(Alliumsativum)、苦參(Sophoraflavescens)、淫羊藿(Epimedium)、石榴皮(Punicagranatum)、菖蒲(Acoruscalamus)等[6]。Harikrishnan等[7]利用大黃(Rheumofficinale)提取物投喂異育銀鯽，可顯著提高其非特異性免疫能力。袁春濤等[8]投喂不同含量的中草藥組方飼料及強(qiáng)普素組方飼喂異育銀鯽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，投喂含0.5%的中草藥飼料能顯著提高異育銀鯽巨噬細(xì)胞吞噬力和呼吸爆發(fā)反應(yīng)氧的產(chǎn)生。李俊超等[9]使用天然植物藥物處理病毒后再感染細(xì)胞，觀察到在一定含量下板藍(lán)根(Isatistinctoria)注射液對(duì)錦鯉皰疹病毒有較弱的直接殺滅作用，而銀黃、炎琥寧等沒(méi)有直接殺滅病毒的效果。各類(lèi)中草藥提取物的應(yīng)用研究也表明，香菇多糖、黃芪多糖、大黃蒽醌提取物等可提高水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫能力與抗病力[10]。雖然在飼料中添加中草藥并應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐已有諸多報(bào)道，但是針對(duì)抗Ⅱ型鯉皰疹病毒效果的中草藥尚未有較大進(jìn)展。筆者選用黃芪、大黃、板藍(lán)根、穿心蓮等4種具有抗Ⅱ型鯉皰疹病毒潛力的天然中草藥作為定制飼料添加劑，旨在為建立有效的防控Ⅱ型鯉皰疹病毒技術(shù)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚(yú)購(gòu)自江蘇省異育銀鯽大豐養(yǎng)殖基地；板藍(lán)根、大黃、黃芪、穿心蓮購(gòu)自同仁堂藥店(上海市東方路店)；飼料原料均由鹽城市恒興飼料有限公司提供；Ⅱ型鯉皰疹病毒病毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；rTag酶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；ACD血液抗凝劑、引物合成均來(lái)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)飼料主要原料為面粉、豆粕、魚(yú)粉，按照《魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)需求》(1993)魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配置基礎(chǔ)飼料，其營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對(duì)照組)、10 g/kg的板藍(lán)根、大黃、黃芪、穿心蓮配置成5 種試驗(yàn)飼料。飼料原料及中草藥經(jīng)粉碎后過(guò)80目篩，混勻后加水壓成粒徑為2.0～2.5 mm的顆粒料，自然晾干后密封4 ℃保存待用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

注：1)預(yù)混料為每千克飼料提供:VC磷酸酯：200 mg;魚(yú)多

維：200 mg; 魚(yú)多礦：600 mg.2)計(jì)算值.

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選用體質(zhì)量為(100±10) g體型均勻的健康異育銀鯽，隨機(jī)分為5組(每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾)，分別飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加10 g/kg(板藍(lán)根、大黃、黃芪、穿心蓮)的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)魚(yú)暫養(yǎng)在水族箱中一周，水族箱半徑0.5 m，高1 m，水體積為0.628 m3，每日9:00、17:00投喂飼料約魚(yú)體質(zhì)量的2%，每次投喂后換水1/3。試驗(yàn)期間保持水溫在(22±1) ℃。

1.4 Ⅱ型鯉皰疹病毒感染異育銀鯽

病毒懸液制備：攻毒，將-80 ℃保存的病魚(yú)組織利用玻璃研磨器研磨后，1×磷酸鹽緩沖液以1∶5比例稀釋組織勻漿液后混勻室溫放置1 h，以3000 r/min離心30 min后，吸取上清液棄沉淀，再次以5000 r/min離心30 min，吸取上清液棄沉淀，以8000 r/min離心上清液30 min，過(guò)0.45 μm濾膜收集病毒液4 ℃保存?zhèn)溆?。定量稀釋病毒懸液至病毒量?.08×107個(gè)/mL，取病毒液1 mL腹腔注射異育銀鯽，對(duì)照組按同樣方法注射滅菌過(guò)的1 mL磷酸鹽緩沖液。感染期間保持水溫約23 ℃，每4 h觀察一次試驗(yàn)組并記錄死亡情況。

1.5 Ⅱ型鯉皰疹病毒鑒定

取10 μL發(fā)病魚(yú)的抗凝血液置于1.5 mL離心管中，利用血液DNA提取試劑盒提取DNA,方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取DNA完畢后，利用Nano Drop 2000測(cè)定DNA含量。鑒定Ⅱ型鯉皰疹病毒引物序列F: 5′-ctt tag cgt cag gtc cat aga gg-3′、 R: 5′-cgt cag tcc ctg gca gaa ata ag-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL：引物濃度為10 μmol/L 各1 μL;10×Buffer 5 μL;dNTP 4 μL; rTaq 酶 0.25 μL;DNA模板1 μL; 加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min; 98 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。配置1%含量的瓊脂糖膠，進(jìn)行凝膠電泳，觀察結(jié)果拍照。

1.6 異育銀鯽血液中病毒滴度測(cè)定

取樣：采用尾靜脈取血法，取異育銀鯽血液加入ACD血液抗凝劑抗凝，放入1.2 mL凍存管中迅速放入液氮罐中冷凍后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存樣品。按照天根血液DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取各樣品DNA，參照本實(shí)驗(yàn)室建立的Ⅱ型鯉皰疹病毒絕對(duì)定量方法[11]進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)病毒滴度進(jìn)行定量。定量前將已提取的DNA全部稀釋為50 ng/μL。病毒熒光定量PCR體系：SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL; PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL; PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL; DNA 模板(<100 ng)×2 μL; ddH2O(滅菌蒸餾水)9.5 μL;加水至25 μL。以稀釋好的病毒DNA為模板在CFX96TM Real-time PCR Detection System (Bio-Rad)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，計(jì)算樣品中的Ⅱ型鯉皰疹病毒含量。

2 結(jié) 果

2.1 Ⅱ型鯉皰疹病毒鑒定

為確定病毒的活性，對(duì)攻毒前的病毒懸液以及攻毒后的異育銀鯽血液進(jìn)行鑒定。攻毒前，取處理過(guò)的Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液20 μL，利用DNA提取試劑盒提取其總DNA，提取方法同說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，鑒定病毒是否正確。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，獲得一條大小約638 bp的特異性條帶，證明病毒懸液是Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液。攻毒后各試驗(yàn)組隨機(jī)取2條異育銀鯽的血液10 μL，處理后提取總DNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得與病毒懸液樣品同樣大小的一條約638 bp的特異性條帶，證明感染成功(圖1～2)。

圖1 Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液DNA凝膠電泳圖M：Marker DL2000； 1：Ⅱ型鯉皰疹病毒懸液DNA PCR產(chǎn)物；2：陰性對(duì)照 3：雙蒸水.

2.2 感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后異育銀鯽的臨床癥狀

感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后，可在各異育銀鯽體表觀察到體表出血，尤其是胸腹部大面積充血泛紅(圖3)；鰓部暗紅且伴有出血；脾臟腫大，肝臟部位有點(diǎn)狀出血；為典型的異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒癥狀(圖3)。

圖2 攻毒后血液中Ⅱ型鯉皰疹病毒 PCR擴(kuò)增結(jié)果M：Marker DL2000；1～10：感染Ⅱ型鯉皰疹病毒血液DNA PCR產(chǎn)物；11 ：陰性對(duì)照.

圖3 感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后異育銀鯽臨床癥狀a.胸腹部體表大面積充血；b.鰓暗紅出血；c.脾臟腫大、內(nèi)臟出血.

2.3 異育銀鯽死亡率及相對(duì)免疫保護(hù)率

投喂飼料過(guò)程直至攻毒，異育銀鯽未出現(xiàn)死亡等異常情況。各均按照魚(yú)體質(zhì)量的2%投喂飼料，于投喂2個(gè)月后進(jìn)行攻毒。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法定量Ⅱ型鯉皰疹病毒滴度為1.08×107個(gè)/mL。口服穿心蓮異育銀鯽死亡率為15%；黃芪和板藍(lán)根試驗(yàn)魚(yú)異育銀鯽死亡率分別為30%和35%；大黃死亡率為95%；普通飼料投喂攻毒死亡率為100%(表2)。

2.4 感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后各不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度情況

利用絕對(duì)定量的方法，對(duì)Ⅱ型鯉皰疹病毒在各血液內(nèi)的復(fù)制情況進(jìn)行定量分析。攻毒后0～120 h病毒處在擴(kuò)增時(shí)期，對(duì)照組在120 h時(shí)病毒滴度達(dá)107個(gè)/mL，對(duì)照組病毒滴度高于其他病毒滴度，且與投喂穿心蓮試驗(yàn)組呈差異極顯著(P<0.01)。

表2 攻毒后異育銀鯽死亡率和相對(duì)免疫保護(hù)率

圖4 異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后血液中病毒滴度誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，*P<0.01差異極顯著.

3 討 論

3.1 Ⅱ型鯉皰疹病毒感染異育銀鯽的臨床癥狀

Ⅱ型鯉皰疹病毒感染導(dǎo)致的異育銀鯽造血器官壞死病，使異育銀鯽出現(xiàn)體表及內(nèi)臟器官大面積出血、眼球突出、腹鰭尾鰭發(fā)白、鰓組織出血等癥狀。Wang等[3]首次報(bào)道了我國(guó)人工養(yǎng)殖的異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的病例，在此之后，在北京、武漢、廣州等地也在養(yǎng)殖異育銀鯽體內(nèi)檢測(cè)出Ⅱ型鯉皰疹病毒[12-13]。Ⅱ型鯉皰疹病毒的廣泛傳播對(duì)我國(guó)的異育銀鯽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失。本研究中，對(duì)照組感染Ⅱ型鯉皰疹病毒后，異育銀鯽體表呈典型癥狀(胸腹部體表大面積充血，鰓部暗紅出血，脾臟腫大、內(nèi)臟出血)與林秀秀等[14]報(bào)道的異育銀鯽感染Ⅱ型鯉皰疹病毒的臨床病變外觀基本一致 。

3.2 中草藥飼料影響異育銀鯽對(duì)Ⅱ型鯉皰疹病毒的耐受性的機(jī)制

本試驗(yàn)中，投喂穿心蓮感染后，異育銀鯽死亡率為15%，其Ⅱ型鯉皰疹病毒病毒滴度低于對(duì)照組。可見(jiàn)穿心蓮在Ⅱ型鯉皰疹病毒的攻擊下對(duì)異育銀鯽起保護(hù)作用。劉妮等[15]將不同稀釋含量的穿心蓮水提取物作用于兔腎細(xì)胞,通過(guò)觀察細(xì)胞病變,結(jié)果表明穿心蓮水提取物體外有明顯的抗Ⅰ型皰疹病毒的作用。吳莎等[16]證明了穿心蓮內(nèi)酯能對(duì)已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的甲型流感病毒 H1N1、登革病毒 2 型、柯薩奇 B 病毒以及呼吸道合胞病毒起到一定的抑制作用。 因此，可推斷在抗病毒作用中，穿心蓮可以對(duì)異育銀鯽起到一定的保護(hù)作用，但不能抑制Ⅱ型鯉皰疹病毒在異育銀鯽血液中增殖，也不能殺死Ⅱ型鯉皰疹病毒。投喂黃芪、板藍(lán)根攻毒后，異育銀鯽死亡率分別為30%及35%，效果較為相近。黃芪中所含有的黃芪多糖，可以提高異育銀鯽機(jī)體非特異性免疫，抵抗病毒的侵襲。這與艾春漢等[17]用黃芪處理鯽魚(yú)后，可明顯看到其白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性及抗菌活力都顯著提高的研究結(jié)果較為一致。李俊超等[9]在細(xì)胞水平先給藥后感染及先感染后給藥中都證明板藍(lán)根具有較弱的殺死錦鯉皰疹病毒的作用，有阻止錦鯉皰疹病毒吸附和穿入細(xì)胞的作用。黃芪和板藍(lán)根以何種方式阻斷Ⅱ型鯉皰疹病毒復(fù)制還有待考證。投喂大黃顯示異育銀鯽死亡率達(dá)95%，與對(duì)照組死亡率相差不大，但其病毒滴度略低于對(duì)照組。劉波等[18]研究結(jié)果表明，投喂大黃蒽醌提取物能顯著提高建鯉(Cyprinuscarpiovar. jian)的溶菌酶、超氧化物歧化酶活性，提高機(jī)體免疫力。投喂大黃試驗(yàn)組對(duì)異育銀鯽保護(hù)效果不佳，推測(cè)是大黃在臨床使用中的生熟選擇以及異育銀鯽對(duì)大黃蒽醌提取物的吸收水平影響對(duì)異育銀鯽的免疫效果。大黃蒽醌提取物在水產(chǎn)病害防治中應(yīng)用廣泛，但主要起到抗菌的作用[19]。

3.3 Ⅱ型鯉皰疹病毒感染異育銀鯽防控方法

迄今為止，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的實(shí)踐應(yīng)用主要有注射、口服和浸泡3種方法。其中使用注射和口服法時(shí)，能有效增強(qiáng)呼吸爆發(fā)及吞噬活力、白細(xì)胞數(shù)目等非特異性免疫因素，從而提高機(jī)體免疫能力，保護(hù)機(jī)體免受病原菌的侵害[20]；注射法效果明顯，但是，由于工作強(qiáng)度大，會(huì)使魚(yú)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，不適用于大規(guī)模飼養(yǎng)；浸泡法可以應(yīng)用于大規(guī)模飼養(yǎng)，但作用時(shí)間短，且受環(huán)境影響大[5]。因此本試驗(yàn)采用口服法，來(lái)降低對(duì)魚(yú)體的刺激。

目前對(duì)Ⅱ型鯉皰疹病毒的研究相對(duì)較少，主要停留在檢測(cè)方法的建立，尚無(wú)有效治療鯽造血器官壞死癥的藥物，多數(shù)都是以預(yù)防為主。洪徐鵬等[21]提出用漂白粉或高錳酸鉀等消毒劑對(duì)親魚(yú)或魚(yú)苗浸泡以預(yù)防該病；俞軍等[22]將聚六亞甲基胍加入異育銀鯽養(yǎng)殖水體中，24 h后進(jìn)行攻毒，保護(hù)率超過(guò)60%。聚六亞甲基胍對(duì)感染3 d和5 d 后的鯽魚(yú)保護(hù)率達(dá) 63.33% 以上，表明聚六亞甲基胍對(duì)Ⅱ型鯉皰疹病毒引起的疾病有較好的治療效果。Zhang等[23]使用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量1×107/mL鯉皰疹病毒Ⅱ型滅活疫苗免疫鯽魚(yú)，攻毒后試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗免疫后機(jī)體形成保護(hù)率為71.4%。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，穿心蓮作為定制飼料藥餌具有一定的抗Ⅱ型鯉皰疹病毒效果，為進(jìn)一步研究預(yù)防及控制Ⅱ型鯉皰疹病毒的傳播提供了參考依據(jù)。

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