肝細胞癌組織中Toll樣受體3的表達變化及其意義

袁明明，任曉燕，謝慧君，王偉偉

(1南通市婦幼保健院，江蘇南通226006；2南通瑞慈醫(yī)院)

原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是發(fā)生在肝細胞與肝內(nèi)膽管上皮細胞的最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全世界腫瘤中居第六位，其病死率在腫瘤中居第二位[1]，江蘇南通地區(qū)的啟東市是世界衛(wèi)生組織確定的HCC高發(fā)研究現(xiàn)場。Toll樣受體3(TLR3)是Toll樣受體(TLRs)家族的一個重要成員，是病毒雙鏈RNA(dsRNA)識別受體。其基因定位于染色體4q35，分子量為117 kDa，其分子結構的主要特征是存在高度保守的toll同源區(qū)。在人類癌腫中觸發(fā)TLR3信號通路主要偏向?qū)е录毎蛲鯷2]。目前關于TLR3在HCC組織中表達情況的相關報道較少。本研究觀察了HCC組織中TLR3的表達變化，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取南通瑞慈醫(yī)院2007年1月～2012年12月間經(jīng)手術切除的HCC患者85例，其中男70例、女15例，年齡19～81歲，平均52.6歲；術前均未接受放療、化療或生物等治療，均經(jīng)病理檢查證實為HCC。術中均留取HCC癌組織及癌旁組織(距腫瘤2～3 cm)處的正常組織標本，常規(guī)10%中性福爾馬林液固定、石蠟包埋以及4 μm切片，備用。

1.2 HCC癌組織及癌旁組織TLR3檢測方法 采用SP免疫組化染色法。兔抗人TLR3購自ABCAM公司。切片脫蠟水化，制成4 μm厚連續(xù)切片；抗原熱修復處理，入Citrate檸檬酸抗原修復液(0.01 mol/L，pH6.0)，微波高火煮沸10 min；室溫自然冷卻，入內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑10 min；PBS沖洗3次，分別加入單抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min； PBS液沖洗3次，加二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸顯色。TLR3陽性染色定位于細胞質(zhì)或細胞膜，呈棕黃色細顆粒狀。按陽性細胞所占百分比測算TLR3陽性表達率。無明顯陽性細胞為陰性，陽性細胞數(shù)<50%為低表達，陽性細胞數(shù)≥50%為高表達。

1.3 隨訪方法 術后隨訪至2017年10月，隨訪方法采用門診復診和電話隨訪；隨訪內(nèi)容包括一般情況、AFP、肝臟B超或CT、HCC是否復發(fā)等。HCC復發(fā)的診斷標準為：B超或CT發(fā)現(xiàn)肝臟實性占位，并參考同期AFP檢測水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料采用雙側χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。對有隨訪結果的病例單因素分析用Log-Rank檢驗并做出Kaplan-Meier生存曲線。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

HCC癌組織及癌旁組織TLR3的陽性表達率分別為58.8%(50/85)、71.8%(61/85)，二者比較，P<0.05。

TLR3表達與HCC臨床病理參數(shù)的關系見表1。由表1可見，TLR3表達與HCC分化程度、TNM分期、復發(fā)有關(P均<0.01)，與HCC患者年齡、性別、HBsAg感染、血清AFP水平、有無肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目及有無脈管侵犯無關(P均>0.05)。

表1 TLR3表達與HCC患者臨床病理參數(shù)的關系(例)

85例患者隨訪率89.4%(76/85)，隨訪時間1～96個月，平均26個月，隨訪頻率1次/3～4月，其中36例術后復發(fā)，43例無復發(fā)。共有72例死亡，71例死于HCC，1例死于其他因素?；颊?、3、5年總生存率(OS)分別為56.6﹪(43/76)、27.6﹪(21/76)、10.5﹪(8/76)。TLR3陰性、低表達及高表達者五年OS分別為0、4.5%(1/22)、25.0%(7/28)，兩兩比較，P均<0.05，見圖1。

圖1 HCC患者的生存曲線

3 討論

HCC是由肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞起源的惡性腫瘤，目前雖然HCC病因尚未完全明確，但目前公認的三大危險因素(病毒性肝炎、飲用水污染和黃曲霉毒素)均可導致體內(nèi)長期慢性的炎癥過程，促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而作為全球最具威脅性的傳染性病原體之一的HBV病毒，是導致慢性肝炎、肝硬化及HCC的主要因素。早期手術切除是HCC目前唯一有效的治療方法，化療和放療大多不能取得滿意效果，因此，分子靶向治療在HCC治療中的研究已經(jīng)迫在眉睫。

TLR3作為先天性免疫反應受體Toll樣受體家族的一員，通過識別高度保守的病原體相關分子模式(PAMPs) 來介導先天性免疫應答。參與炎性細胞因子的釋放，并誘導宿主初始的抗細菌及抗病毒反應。TLR3激動劑的應用不僅能夠促進先天性免疫反應，還可增強抗體依賴性效應功能及適應性免疫反應。TLR3可能成為治療某些癌癥的關鍵性靶點。TLR3已被證實在多種腫瘤細胞如乳腺癌、結腸癌、肺癌及黑色素瘤中均可表達，但其相關作用機制并未完全闡明[3～5]。在HCC中，TLR3被認為可能是其通過下游分子諸如caspases、INF-γ或者NF-κB等來影響腫瘤的血管生成及腫瘤細胞的生長或擴散等關鍵過程[4]。Yoneda等[5]證明TLR3表達于HCC細胞的胞膜及胞質(zhì)，52.7%的肝細胞癌組織切片呈TLR3陽性。細胞質(zhì)中TLR3可能參與了細胞凋亡，而細胞表面的TLR3則誘導激活了其下游的NF-κB途徑。由dsRNA激活的TLR3直接抑制細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡[6]。有學者[7]發(fā)現(xiàn)HCC腫瘤細胞TLR3高表達的患者，其平均生存期高于低表達的患者，證實了TLR3通路的激活在腫瘤微環(huán)境中的作用。TLR3在HCC中的表達與細胞凋亡及血管生成存在密切關系，提示TLR3的下調(diào)使控制細胞增殖和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的生理性生長調(diào)控機制發(fā)生紊亂，從而使細胞惡性轉(zhuǎn)化[8]。Eiró等[9]發(fā)現(xiàn)TLR3在HCC細胞的表達與HCC腫瘤大小有關，而腫瘤大小是公認的HCC預后最重要的指標。最近也有學者[10]證實TLR3基因的多態(tài)性+1234 C/T與HCC的易感性有關，基因多態(tài)性可能是HCC一種新的危險因素，尤其是HBV相關的HCC。

HCC病死率位居全世界腫瘤中第二位。近年來歸因于更好的治療方案及監(jiān)測方法，HCC患者5年OS有所提高，發(fā)達國家更是達到17.0%[11]。TLR3激動劑也是有效的免疫佐劑，并且已經(jīng)在癌細胞的誘導凋亡中發(fā)揮較好效果。TLR3作為一種靶向治療癌癥的新型分子，目前已經(jīng)得到了重新認識。TLR3其合成的配體poly(I:C)能夠誘導腫瘤細胞凋亡，并可抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[12,13]。另一種TLR3 dsRNA激動劑BM-06也能夠抑制HCC腫瘤的生長及腫瘤細胞的增殖，并且優(yōu)于poly(I：C)[14]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，HCC癌組織中TLR3的陽性表達率明顯低于癌旁正常肝組織，表明HCC癌組織中存在TLR3的表達下調(diào)。通過比較HCC中TLR3表達與HCC臨床病理參數(shù)的關系，我們發(fā)現(xiàn)在HCC低分化程度、TNM高分期及腫瘤術后復發(fā)時，TLR3表達水平均下降，表明了TLR3對HCC發(fā)生、進展發(fā)揮負性調(diào)控作用。高表達TLR3的HCC患者臨床預后較好，其可作為HCC患者預后良好的判斷因子。

綜上所述，HCC癌組織TLR3表達降低，TLR3可能參與了HCC的發(fā)生、發(fā)展。

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